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1中華大學生物資訊學系92級專題報告DNA聚合脢連鎖反應(PCR)增幅子克隆載體之設計ThedesignofacloningvectorforPCR(polymerasechainreaction)amplicons專題組員:周鳶聲、吳宗吉指導老師:張慧玫老師專題編號:PRJ2006-BIOINFO-9214執行期間:95年4月至95年12月摘要載體的應用對於生物科技產業而言是相當重要的一環，而傳統的載體提供方式無法滿足成本效益的需求，為此我們結合了節省開支與再生利用的精神，想出了一套將已經使用過的載體做[再生]的想法，並應用於校內的廢棄載體再利用計畫上。此實驗根據??載體的內容，設計出適合的再生方式，並依據不同的需求可以開發出多種版本。在實驗的過程中，載體不僅可以做整體性的重製再生，並可針對不同的部分修改內容。載體內容、基因檢測、與再生利用將會一一呈現。此廢棄載體再生實驗的研發不但讓載體能更有效率地使用；並且以學校的角度而言，更節省了重複性的資源耗費，提高教學成效。DNA聚合脢連鎖反應(PCR)是近年生物科技與生物資訊資料爆增的主要關鍵技術之ㄧ。針對”任一聚合脢連鎖反應所得之增幅子為混合物，通常必須經過克隆步驟，經挑選後，才能獲得預計產生的單一純化增幅子片段”的這個需求，本專題預計研製一個PCR專用克隆載體。關鍵詞：生物科技產業、載體的再生利用、節省資源耗費、聚合脢連鎖反應(PCR)一、簡介生物科技產業對於載體的需求量向來特別高，而傳統的載體選用方面，大都採取用完就丟棄的方式，在經費上的考量下，可能希望有可以多次使用的產品，因此必須省去一些耗材的支出，常造成經費上面的難以取捨，而無法發揮應有的工作效率。而且常常以廉價的替代品代替、在本專題裡，可以使得重要的載體有重生的機會。而且不必耗費大量的財力資源在訂購一些重複性的載體上，將造成資金無法達到應有的效益，雖然也有資金夠多的方式來解決此一問題，但是如果可以實驗成功，將代表可以省下更多的資金，使多餘的資金可以另做用途。此外，由於現代化的貨物轉運大都透過宅配來進行，在避免失誤造成嚴重損失之前，使用經由自己監控下所再生的載體，可確保安全無虞，也可省去不夠要再多訂或是訂太多的小麻煩。因此讓載體的取得能有一套更快速、更簡單的方式來獲取，在有限的經費與方便性的考量下，如何在最簡單的實驗內，做到最佳的再生品2質，就成為此實驗上要求的目標。有鑑於此，本組（載體的應用與再生利用）將利用pOSI-T載體做再生的示範。本計劃的目的在於協助有需求之部門，做出其所需的再生載體，進而協助各部門可於未來自行再生與減少經費的支出。並藉由此實驗期能達到降低所需的經費與人力，提高學習興趣與效率等目標。在再生實驗期間，我們嘗試運用不同的再生方法，遇到諸多瓶頸，最後經過各方考量，決定以重建PCR的置入點為基礎來進行再生。在實驗設計方面則依據不同實驗的特性，搭配適合的實驗方式，有別於以往文字化的靜態教學方式，讓實驗時更有興趣且還可以學習。在本文中，我們將會在第三節中詳細介紹專題的進行方式，主要困難及解決之道、樣本分析與設計摘要、實作平台與技術；而在第四節中，我們將提出專題的研製成果、完成的實驗及效益分析；在第五節裏，將對目前實驗結果作評估，比較預期與實際成效的差距，以及未來的擴展方向，並說明學習心得，最後，在第六節中，將對整個專題提出總結。本專題研製背景：DNA聚合脢連鎖反應(PCR)是近年生物科技與生物資訊資料爆增的主要關鍵技術之ㄧ，這技術的普及使得目前在任何遺傳工程相關研究中，聚合脢連鎖反應變成了例行操作。DNA聚合脢連鎖反應，就是將特定的目標DNA片段，經由PCR聚合脢連鎖反應增幅放大，增幅放大所得的DNA產物叫做增幅子(amplicon)。聚合脢連鎖反應產物的增幅子，通常不只是含有預計產生的單純一種DNA片段，其他由引子偶爾錯誤結合的產物(如：雜訊noise片段)也存在。所以任一聚合脢連鎖反應所得之增幅子混合物，通常必須經過克隆步驟，經挑選後，才能獲得預計產生的單一純化增幅子片段，此時這個單一純化增幅子片段，才能進行有可讀性的增幅子序列讀序反應，與其他後續實驗操作步驟。載體是一種在遺傳工程中，能攜帶外源DNA片段的承載用途的工具DNA，可獨立而穩定的存在染色體之外。常用的有病毒原有的獨立DNA或細菌原有的質體。我們可將有興趣的DNA和載體作線性接合後，再將其導入細菌或其他細胞中，來研究這有興趣基因的表現等。本專題研製目標：針對PCR產物特性的兩個需求。(1)任一聚合脢連鎖反應所得之增幅子混合物，通常必須經過克隆步驟，經挑選後，才能獲得預計產生的單一純化增幅子片段。(2)PCR產物在複製擴幅時，其複製脢Taq聚合脢會額外在3’多加了一個A序列，這是母本模版DNA所沒有的，使PCR產物DNA雙股的一邊多一個A，於是不能用一般其坪的線性接合作克隆動作，必須用特殊載體，在載體DNA雙股的一邊多一個T序列來承載PCR產物。3本專題預計研製一個PCR專用克隆載體。我們預計改版pOSI-TPCR商用載體。pOSI-TPCR載體是屬於正面選擇性載體(positiveselectionvector)，實驗中因PCR產物內接失敗的空載體會自動死亡，凡是長的出來的，都是PCR產物內接成功的重組載體。這種以致死基因作正面選擇性的載體，很受歡迎，但都只有一次使用性而已，原因是它的製備方式，比較不為人知或因商業機密而不普及。主要預期效益：本專題研製的PCR專用克隆載體，可提供學弟妹以後PCR克隆時，載體無限量供應。本專題也可學習載體設計理念與實作。二、專題進行方式首先老師帶我們開始了解一般載體的主要結構，看它是由哪些酵素組成以及又有哪些內容物。本專題是以GeneMark公司出品的pOSI-TPCR載體作為改製的母本載體(如圖一所示)。pOSI-T全長3313個鹼基序列。含有pUC與f1的複製起點，克隆鑑別區有kanamycin抗生素基因區與lacZccdB致死融合基因區。kanamycin抗生素會宿主細菌在轉殖後可生長在含kanamycin抗生素的培養基上，其他不含載體(沒轉殖成功)的宿主細胞因為長不出來，就可以被淘汰。LacZccdB致死融合基因區，是由原來的lacZ基因改版的，lacZ基因是一般克隆以藍白顏色反應作篩選轉殖成功菌株的酵素基因工具。現在特別將ccdB致死基因融合在lacZ基因的後段，目的是使lacZ基因轉譯時一並將ccdB致死基因也一起製造出來。ccdB致死基因會使空載體自我接合的宿主細菌致死，這是用來淘汰載體中不含增幅子(amplicon)的(沒接合成功)。而含增幅子(amplicon)的接合成功的會因為lacZccdB致死融合基因區被增幅子(amplicon)的接合嵌入造成轉譯中斷，使得ccdB致死基因不能害死含增幅子的宿主菌。也就是說真正轉殖成功又接合成功的就會存活而不死在含kanamycin抗生素的培養基上。接著由此載體所準備好的切入點開始研究，發現PCR專用克隆載體的特點是在切開處的3’端都會多一個T鹼基序列，這是因為通常DNA產物的增幅子(amplicon)在聚合脢作用下會在的3’端多一個A鹼基序列。為了製造一個切開處的3’端都會多一個T鹼基序列，因此開始去找由GATCXGATC排列組成的XXN/XX的酵素來修改舊的切入點。此酵素還要保證不能在載體裡面有一樣的，不然用酵素切入時，載體會被切好幾段。經過搜尋之後，發現AhdI酵素吻合並開始修改切入點，切4入點的序列裡面除了AhdI此酵素之外，加入了多個stopcodons(3readingframes)總共52的字來阻斷此序列，用來放置要量產的使用者的PCR。內圈5’AATTCGACCCT↓TGGTCTAAGTAGGGTGAAGTGGGATGAATGACCCA↓TGGTCG3’外圈5’AATTCGACCAT↓GGGTCATTCATCCCACTTCACCCTACTTAGACCAA↓GGGTCG3’切入點修改完之後，我們開始尋找廠商訂購我們需要重建切入點的酵素(由細胞科技公司)以及修改的序列。之後我們開始養含有此載體的細菌，接著純化抽出且收集細菌的質體DNA，但是DNA抽不出來疑似細菌早已經死亡，因此老師教我們兩種方法看能不能重新養出活的細菌。一種是收集已死細菌的屍體，抽出它的質體DNA在放入培養皿養；另一種是直接拿冷藏的DNA，都同時拿到質體DNA的時候，在42°C的水中將細菌放入30秒使其細胞膜開啟，注入DNA讓細菌吸入之後，把裡面的細菌吸到培養皿上等待幾天，結果還是沒有細菌的蹤影。現在我們已由交大環工所取得使用過的pOSI-T載體，並以純化為DNA，只要以EcoRI限制脢(已購買好)切開純化，就可將雙股已設計完成的52個序列以線性接合(接合脢已購買好)，即可轉殖到宿主大腸菌做改版後的正面選擇。完成改版作品。改版作品會因我們刻意設計的stopcodon阻斷致死基因，克服了使用者不能重複製備，只有一次使用性的限制。使用時只要將改版載體以AdhI切開，就可以製造一個切開處的3’端都會多一個T鹼基序列，等待PCR產物隨時接入了。此時，被AdhI切開的片段含設計完成的52個序列將被丟棄，ccdB致死基因區將恢復致死能力，使得PCR產物內接失敗的空載體會自動死亡，凡是長的出來的，都是PCR產物內接成功的重組載體。完全與商用載體一樣好用。簡略流程：pOSI-T載體↓(EcoRI限制脢切開純化)純化pOSI-T載體↓52個序列以線性接合↓轉殖到宿主大腸菌↓將改版載體以AdhI切開↓等待PCR產物隨時接入(成品)實驗設備實驗設備實驗設備實驗設備本實驗所使用的重要儀器，包括聚合酶連鎖反應器（今日儀器Primus25Advanced）。其他設備，如水平電泳槽（Sub-CellGTAgaroseGelElecetrophosresisSystem,Bio-Rad）、照膠系統含軟體（KodakEDAS290,Kodak）及微量離心機（Biofugepico,Heraeus,Kendo）及電源供應器（PowerPAC300,Bio-Rad）。5實驗方法實驗方法實驗方法實驗方法1.PCRPCRPCRPCR聚合酵素鏈鎖反應聚合酵素鏈鎖反應聚合酵素鏈鎖反應聚合酵素鏈鎖反應聚合酵素鏈鎖反應(PCR)是一個簡便而有效的方法,它可使DNA在微量試管中擴增至106X以上。這個方法的原理十分簡單,在要擴增的DNA片段兩端分別設計一個前置引子(forwardprimer)和反置引子(reverseprimer)使之與已變性的單股目標DNA緩冷配對(annealing)後,利用DNA聚合酵素(DNApolymerase)以目標DNA的兩股分別做為模板(template)來合成新的DNA股。像這樣經由(1)變性反應(denaturation),使DNA的兩股分離。(2)緩冷配對反應(annealing)，使引子與目標DNA配對。(3)延長反應(extension)，合成新的DNA股。的循環操作每次可使DNA的量添加一倍，若重複操作多次，以數學公式計算，DNA增加的量將會是2n，n是代表重複操作的次數。在理想的聚合酵素鏈鎖反應條件下，DNA是以幾何級數增加。理論上，一個DNA分子若重複操作PCR25次，那麼DNA的分子數將會擴增到225=106個分子。這個DNA的量已足夠在Agarose凝膠電泳中觀察到。PCR操作過程主要分成三大部份:(一)以高溫(92℃-95℃)使雙股模板DNA分離(denature)，(二)使引子與單股模板DNA做緩冷配對(40℃-52℃)，(三)再將溫度調整到DNA聚合酵素作用的有效溫度而合成新的DNA股。一般使用的DNA聚合酵素的有效作用溫度是37℃，因此在高溫分離雙股時會破壞DNA聚合酵素的活性，然而在耐高溫的細菌(Thermusaquaticus)中分離出來的DNA聚合酵素(TaqDNApolymerase)在95℃中其活性的半衰期(halflife)長達40分鐘，故可供PCR操作使用。Taq聚合酵素的有效作用溫度為72℃，在這溫度下，每分鐘可合成2000-400