中南大学生物科学与技术学院

中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教案授课科目:医学分子生物学授课内容:基因治疗授课对象：临床医学七年制、八年制授课时数：4学时授课教师：授课地点：湘雅医学院新教学区授课时间：授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材），胡维新主编，北京：科学出版社，2007年2月，第一版；医学分子生物学（卫生部8年制规划教材），冯作化主编，北京：人民卫生出版社，2005，第一版一．目的要求掌握：基因治疗的概念、基本策略、常用载体；治疗基因的受控表达原理与方法。熟悉：基因转移的基本技术；基因干预的基本策略；基因治疗的应用研究。了解：基因转移的靶细胞;基因治疗的前景与问题；人类生殖细胞基因治疗研究的伦理学问题。二．讲授重点：基因治疗的策略：如基因置换、基因添加、基因干预、自杀基因治疗、免疫基因治疗等；体内基因转移的方法。三．讲授难点：不同类型的疾病应采用不同的治疗策略；基因干预方法与原理；治疗基因的受控表达原理与方法。四、教学方法：多媒体教学五、教具：多媒体课件六、讲授内容：何谓HumanGeneTherapy？基因治疗是现代分子生物学技术与医学科学交叉渗透而形成的一个全新治疗领域。DNA重组、基因转移、基因克隆和表达等技术的迅猛发展，为基因治疗的飞速发展奠定了基础。基因治疗分类体细胞(somaticcell)基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代生殖细胞(germline)基因治疗对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代第一节基因治疗的策略1．基因治疗的概念定义：将目的基因导入靶细胞内，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。不同的基因治疗策略是以不同的形式利用基因产生治疗效应，因而适用于不同疾病的治疗。2．基因置换（genereplacement）定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。又称基因矫正（genecorrection）。目的：纠正缺陷基因，将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。基因置换的必要条件：对导入的基因及其产物有详尽的了解；外来基因能有效地导入靶细胞；导入基因能在靶细胞中长期稳定存在；导入基因能有适度水平的表达；基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害。基因同源重组技术（homologousrecombination)又称为基因打靶(genetargeting），其实现定点整合的条件:转导基因的载体具有与染色体上的DNA相同的序列。这样，带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点进行部分基因序列的交换。要实现基因置换，需要采用同源重组使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。考虑到正常体细胞的生命周期，以及克隆筛选等实验给细胞生长带来的一系列问题尚未解决．因此用同源重组修复异常基因的方法进行遗传病的基因治疗只能作为远期目标。3．基因添加基因添加或称基因增补（geneaugmentation）:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型:针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基因，使导入的正常基因整合到基因组中，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。基因添加与基因置换一样，也必须具备上面提到的5个必要条件。4．基因干预基因干预（geneinterference）:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。此类基因治疗的靶基因往往是过度表达的癌基因或者是病毒的基因。较常用的方法是采用反义核酸、核酶或者干扰RNA技术等抑制基因的表达。5．自杀基因治疗恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。图示：自杀基因的作用机制（约2分钟）（一）自杀基因系统TK/GCV：单纯疱疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，或作为DNA链延伸的终止子阻止DNA合成，导致细胞死亡。CD/5-FC：大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。（二）旁观者效应概念:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。远距离旁观者效应：近年来又有人观察到该效应也影响到远处的肿瘤细胞，使其消除或停止生长，即远距离旁观者效应。肿瘤细胞的消除有赖于旁观者效应，即转导自杀基因可以影响没有被转导的肿瘤细胞。旁观者效应明显地增强了自杀基因对肿瘤的杀伤作用，在相当程度上弥补了基因转导效率低的问题。旁观者效应的机制细胞缝隙连接；细胞凋亡与吞噬；免疫炎症反应；抗肿瘤血管生成等。6．基因免疫治疗通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。（1）基因修饰肿瘤细胞“疫苗”疗法。（2）基因修饰TIL的过继免疫疗法。（3）免疫增强基因疗法。（4）原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法。第二节基因转移技术图示基因治疗的两种途径。exvivo(经活体)，即将靶细胞在体外导入外源基因及体外增殖、筛选、药物处理或其他操作后，再输回患者体内。invivo(活体内)，即将无复制能力的、含外源基因的重组病毒直接应用于患者体内，此外还包括将脂质体包埋或裸露DNA直接注射到试验者体内等方法。1．病毒介导的基因转移系统（生物学方法）病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，而其中用得最多的是逆转录病毒载体(retrovirusvector,RV)。（一）逆转录病毒载体逆转录病毒是一种RNA病毒，其感染颗粒是由包装蛋白包装的两条RNA链组成，两条RNA链5ˊ端经氢键连接。包膜上的突起由外膜糖蛋白和穿膜蛋白组成。病毒包膜上有型、亚属特异性抗原决定簇，由外膜蛋白基因(env)编码；在病毒核心内有属特异性抗原，由属核心蛋白基因(gag)编码。当逆转录病毒进入宿主细胞后，即由逆转录酶转录成环状双链DNA分子，并随机整合至宿主细胞基因组，称为前病毒(provirus)，然后再转录成RNA，并合成包装蛋白，将转录的RNA基因组包装后分泌至细胞外，完成一个完全的生活周期。图示逆转录病毒的结构及生活周期逆转录病毒前病毒的结构特点：（1）两端各有一长末端重复序列LTR；（2）LTR由U3、R和U5三部分组成：在U3内有增强子和启动子；U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)；在R内还有poly(A)加尾信号。（3）病毒有三个结构基因：gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；pol基因，编码逆转录酶；env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)；（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列ψ及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)；（5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。图示逆转录病毒感染及复制过程。逆转录病毒载体为缺陷型逆转录病毒基因组，它由两部分组成：(1)逆转录病毒载体：保留病毒颗粒的包装信号ψ，而缺失病毒颗粒包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源的治疗基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。另一部分为包装细胞，它由另一种缺陷型逆转录病毒（即带有全套病毒颗粒包装蛋白基因，却缺失包装信号ψ的逆转录病毒）感染构建而成，该细胞株能合成包装蛋白，用于逆转录病毒载体包装，但本身却不能包装成辅助病毒颗粒。将上述两部分结合使用，即可产生携带治疗基因，而只有一次感染能力的重组逆转录病毒颗粒。图示逆转录病毒载体系统的组成。逆转录病毒载体的特点：①逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体所识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。逆转录病毒载体的主要缺点：随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。（二）腺病毒(adenovirus，AV)载体腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导内吞作用进入细胞内，后被腺病毒基因组转移至胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联，其宿主细胞范围广泛，可感染分裂和非分裂终末分化细胞如神经元等。图示腺病毒结构特点及感染过程。腺病毒的优点：基因导入效率高，对人类安全；宿主范围广；基因转导与细胞分裂无关；重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外源基因腺病毒载体缺点：1）不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。2）宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂的关键性因素之一。3）有两个环节可能产生复制型腺病毒：腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组；腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。4）靶向性差。（三）腺病毒相关病毒载体腺病毒相关病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒，是目前所发现的动物病毒中最小的病毒，其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒存在的条件下才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。图示AAV的结构。AAV生命周期的特点：●单独不能进行复制；以潜伏感染为主；●病毒基因组与细胞共存；●只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；●若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制；●产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。其中一种B19病毒可以高效定位整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。AAV载体的缺陷：AAV载体容量小，目前最多只能容纳5kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。（四）单纯性疱疹病毒(herpessimplexvirus，HSV)载体HSV具有许多天然特征，适合作为神经组织的基因转移载体：在不同的神经细胞中可建立长期潜伏状态；在病毒进入细胞和建立潜伏状态时，不需要宿主细胞的分裂；在神经元细胞核中，病毒基因可持续存在，不整合至宿主细胞的染色体中，避免了因整合而使宿主细胞基因失活或激活原癌基因的潜在危险。HSV载体的优点：1）HSV中有许多基因，切除后可明显阻碍其在体内的复制，使之丧失神经毒性；2）切除大部分病毒基因的重组HSV，可克隆较大的外源基因片段甚至多个基因进行转移，而不影响病