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《高等微生物学》讲义主要内容：1．绪论、微生物的分类学2．微生物生态学3．微生物的生长与分化规律4．微生物的代谢5．读书笔记评讲6．微生物的发酵工程第一章绪论1．现代微生物学当今微生物学各个领域之间的延伸和相互交叉，微生物学与其它学科间的相互交叉，是构成现代微生物学的显著特点。因此，现代微生物学并非生物学中的科学名称，而是强调以现代科学理论、知识和技术论述微生物的基本原理。现代微生物学的基本概念包括：研究原核生物系统进化的分子分类和多相分类理论和技术；研究被人们认为是生物进化第三生命形式的古菌；研究物种丰富和最有应用潜力的真菌分子系统学；研究与基因工程和人类健康越来越密切的病毒学；研究在维持人类生存环境生态平衡发挥重要作用的微生物分子生态学；探讨微生物生命活动规律的微生物生理学；介绍生化代谢过程分子表达与调控、代谢网络概念的微生物生物化学；论述遗传工程理论和应用中的原核生物基因表达；转座因子的结构、功能，组成型转座和保守型转座机理及逆转座子；噬菌体的双链DNA、单链DNA和RNA噬菌体为代表，讨论转录和翻译机制质粒的滚环复制、θ复制、反义RNA对复制调节分配及稳定性机制；真核生物三种RNA聚合酶转录基因的方式及调节机理，以及mRNA前体内含子加工方式、机理和翻译后加工等的遗传学；介绍免疫器官、免疫细胞和免疫分子结构和功能；抗原诱导的免疫应答过程；抗原的分子结构及淋巴细胞对抗原识别的分子机理；噬菌体抗体文库和基因工程的应用研究；抗感染免疫学和抗肿瘤免疫学在临床中的应用免疫学。2．现代微生物学的主要研究领域2．1分子系统学（Molecularsystematic）是指在分子或基因水平上研究微生物系统进化和物种多样性的科学。在早期地球大气处于还原态的环境中自然生成第一个非常原始的细胞，并开始进化。原始生物必须具备两种特性：（1）代谢，能够转化能量和营养；早期的代谢是厌氧，可能化学异养或化学自养。生成FeS2可能最早的代谢方式→随时间推移，突变或选择可能产生对化学环境变化有更好调节作用的代谢方式→最终是基于卟啉的光合作用产生；光合作用首先是厌氧→而后才是有氧光合作用并→导致有氧大气的出现及其它高等生物的进化。（2）遗传，能分配和传送它的遗传特性给子代。原始生物细胞中的RNA是惟一的生物大分子，即所谓的“RNA生命年代”。可能最先使用RNA负责遗传信息和酶的组合，然而这种RNA并非十分有效于生物催化；接着蛋白质的出现和催化作用显著改变了细胞生活。作为细胞基因的DNA开始建立，并在进化另取代了RNA作为遗传信息的储存形式。这样DNA、RNA和蛋白质就成为生物进化系统的物质基础。在漫长的生物进化中，微生物生境的多变引起了由核酸构成的基因突变和重组的频繁发生，结果是导致微生物生长、遗传变异和消失的进化和分化过程。→多样性的呈现。rRNA是发现于所有细胞生物中的古老生物大分子，可以很好地用来研究染色体的进化。地球上的细胞生物是沿三个主要分子进化线发生的，它们是原核（prokaryotes）中的细胞、古菌（Archaea）以及真核生物（Eukarya）。2．2分子细胞学2.3分子生态学是指利用现代微生物学理论，分子生物学和化学技术研究微生物生态系（microbialecosystem）的结构和功能的科学。微生物的种群和数量组成了微观生态系统的结构，微生物与环境间的相互作用过程所表现出的宏观效应构成了微生物生态系的功能。最近分子生态学研究发展十分活跃，出现了许多新的研究方法和手段。如“未培养微生物”、“荧光抗体和染色技术”、“核酸探针技术”等。无论是荧光抗体和染色技术”、“核酸探针技术”，其只能检测微生物生态系的结构，并不能说明微生物的生物功能活性。因此微生物生态学研究中还需要发展用于检测天然环境中微生物活性的方法。2．4分子遗传学不是所有的细胞蛋白均按同等比例合成。蛋白质的合成受到一个复杂的基因的调节系统控制。2．5分子病毒学2．6分子免疫学研究免疫反应分子机理。免疫检测、诊断和治疗；疫苗、药品设计生产3．发酵工程应用微生物细胞或酶进行产业化生产的过程科学。一个完整的发酵工程可以示这：SP即：（1）原料（2）生物催化介质（细胞、酶）（3）提取制备Biomass第二章微生物的分类学原核生物的描述与定义细胞结构表现有3项特点：（1）基因载体上同不具有核膜而分散在染色体中的双链DNA所组成；（2）缺乏由单元膜隔开的细胞器；（3）核糖体为70S型，而不是真核生物的80S型。1．现有原核生物分类系统1．1原核生物的分类学1.1.1分类、命名和鉴定分类、命名和鉴定是分类学中相互关联的三要素。分类学的目的在于将所有的生物按其相似性进行归群，并依据各群间亲缘关系的密切程度排列成一个等级系统，这个系统应尽可能地反映各生物种群间自然的系统演化关系，每个种群在这个系统中都有自己的正确位置。命名就是按国际准则给每一个物种一个公认的名称。林奈氏双名法则。鉴定则是确定一个新分离物的特征，并将其归属于已存在的分类单位中的过程。1.1.2原核生物分类中采用的分类单位从高到低分为：界(Kingdom)、门(Division)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)、种(Species)。每一个分类阶元还可有亚级。种是分类等级的基本单元。关于细菌种的概念在人们认识中存在分歧。1987年国际细菌分类委员会颁布，DNA同源性≥70%的菌群可定为一个种。1994年Embley和Stackebrandt认为当16SrRNA的序列同源性≥97%时也可认为是一个种。但多相分类研究认为一种的确定不应只依据一个单一的标准。（什么是种？）属是种的高一级分类阶元，通常包含具有某些共同特征或关系密切的种。Goodfellow和ODonnell（1993）认为DNA的G+Cmol%差异≤10%~12%及16SrRNA的序列同源性≥95%的种可归为一个属。1.1.3原核生物的分类系统目前国际上公认和普遍采用的分类系统是伯杰氏（Bergey’s）分类系统；《原核生物》系统是近年来根据16SrRNA序列同源性建立的系统发育体系。1.1.3.1伯杰氏（Bergey’s）细菌分类系统《伯杰氏（Bergey’s）细菌鉴定手册》，由美国细菌学家协会发起编定，1923年出版了第一版，随着细菌分类学研究的深入和发展，相继在1925、1930、1934、1939、1948、1957、1974和1994年出版了第二至第九版。1984年至1989年出版的四卷册《伯杰氏系统细菌学手册》第一版，在着重于表观特征描述的基础上，结合化学分类、数值分析特别是DNA相关性分析，及16SrRNA寡聚核苷酸编目在生物种群间的亲缘关系研究中的应用作为详细阐述，体现了细菌分类的研究从表观向系统发育体系的发展。该手册将所有细菌归属于原核生物界，分为4个门：（1）薄壁菌门：暗细菌纲、不产氧光合细菌纲、产氧光合细菌纲；（2）厚壁菌门：厚壁菌纲、放线菌纲；（3）软壁菌门：柔膜菌纲；（4）疵壁菌门：古细菌纲。1.1.3.2《原核生物》分类系统1981年Stanier等主编的第一版《原核生物》对原核生物界的全面认识起到了重要作用。1991年由Balows等主编的《原核生物》第二版完全遵照原核生物系统发育的顺序描述了每个分支上细菌的属或更高的分类单元。这个原核生物系统发育是以CarlWoese的核糖体RNA序列同源性为基础的，首次为单细胞的原核生物建立了真正的系统发育树。Woese之所以选择rRNA作为研究原核生物系统发育的工具，是因为它具有如下特征：作为蛋白质合成的场所rRNA存在于所有生物的细胞中；分子序列进化缓慢，具有“分子计时器”功能；分子的长度为1.5kb，具有保守的二级结构和由保守程度不等的区域组成的一级结构。因此，16SrRNA序列同源性不仅建立了原核生物系统发育学，而且还证实了原核生物由古菌和细菌两大群组成，二者间的亲缘关系不比它们之一与真核生物的关系更密切，表明生物是以三种形式存在的，从而定义为古菌域、细菌域和真核生物域，“三域论”的提出。1．2常用的分类方法1.2.1经典方法1.2.2DNA指纹技术（DNA-fingerprintingtechniques）DNA指纹技术（DNA-fingerprintingtechniques）通常指那些以DNA为基础的分型方法，对微生物的种进行鉴别的技术。（1）RFLP分析法:最早的DNA分型方法是全细胞基因组限制性酶切片段分析。即提取全细胞基因组DNA，用限制性内切酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分析限制性酶切片段长度多型性，即RFLP分析（restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis）。缺点是DNA酶切片段往往较复杂，难以比较。（2）LFRFA（low-frequencyrestrictionfragmentanalysis）:即选用专一识另6-8个碱基序列的限制酶内切，则DNA片段数量大大减少，称为低频限制性本科切片段分析。但这样的DNA片段大大不能用琼脂糖凝胶电泳分开，只能用脉冲场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelctrophoresis,PFGE）分开。（3）核酸分子印记（ribotyping）分析：DNA酶切后电泳，然后转移到膜上与标记的rDNA探针进行杂交的一种方法。特点是简便快速。其原理是将同一属的实验菌株与该属有效描述的模式菌株提取DNA，进行DNA酶切片段与非同位素（地高辛，DIG，）标记的rDNA探针杂交以比较分类单位间的DNA同源性。（4）PCR技术出现后，应运而生：随机引物PCR（arbitrarilyprimedPCR,AP-PCR）分析、随机扩增的多型性DNA分析（randomlyamplifiedpolymorphicDNAanalysis,RAPD）、DNA扩增指纹分析（DNA-amplifiedfingerprinting,DAF）；DNA扩增与限制性酶切分析相结合的扩增rDNA限制性酶切片段分析（amplified-rDNArestrictionanalysis,ARDRA）：首先对16SrDNA、23SrDNA或二者的部分基因和间隔区用位于保守区的通用引物进行PCR扩增，然后选择一组限制性内切酶对扩增片段进行RFLP分析，通常可以产生一些种特异片段。扩增片段长度多型性分析（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）：其基本原理是基于选择性扩增片段的RFLP分析，即用两种限制性内切酶消化细菌的总DNA，并将接连接头连接到酶切片段的末端作为PCR模板，再用两对与接头序列和酶切位点序列相对应的引物进行选择性PCR扩增，对PCR产物进行电泳分析，可得以种群或菌株特异的片段。1.2.3RNA同源性分析现在一般认为rRNA是研究系统进化关系的最好材料，它广泛存在于真核和原核生物，功能稳定，由高度保守区和可变区组成。5SrRNA分子较小，所含信息量太少；而23SrRNA分子大（2900bp）且信息量多，但碱基突变速率要比16SrRNA快得多，对于较远亲缘关系不适用。16SrRNA其大小为1500bp左右，所代表的信息量即能反映生物界的进化关系，又较容易进行操作，适用于各级分析单元，因此是目前进行系统和进化研究的最理想材料。两个重要的发现使DNA-rRNA杂交技术成为研究遗传和分类关系的有力工具：一是偶然发现单链DNA可能固定到硝酸纤维素膜上（1963，1965年），这在基因DNA-rRNA杂交中十分重要；另一个是发现核糖体RNA（rRNA）基因在进化过程中比DNA更为保守（1965，1967年），这使得rRNA在研究分类和系统发育上具有DNA-DNA杂交所不可比拟的优越性。DNA-DNA杂交反映种及亚种水平的信息；DNA-rRNA杂交反映的是属与属以上水平的信息（1977年）。1.2.3.116SrRNA序列分析主要有两种方法：一种是16SrRNA提纯后用反转录酶和保守引物进行测序；另一种是扩增16SrRNA基因的16SrDNA，