【生物课件】植物DNARNA及蛋白的提取与分析

植物DNA、RNA及蛋白的提取与分析植物DNA提取DNA提取原则保证DNA结构的完整性排除有机溶剂和金属离子的污染排除其它核酸分子的污染蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度纯化后不应存在对酶抑制性的物质植物DNA提取的方法CTAB法SDS法煮提法--植物DNA提取的经典方法DNA提取的基本步骤材料的准备（新鲜或冷冻保存）细胞的裂解（液氮研磨，释放内容物）DNA的分离与纯化（酚氯仿抽提）DNA的沉淀与洗涤（2V无水乙醇或2/3V异丙醇）DNA的干燥与溶解（ddH2O或TE）CTAB法流程离心洗涤植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解沉淀CTAB提取液主要成分CTAB：十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。Tris-HCl(pH8.0):提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。EDTA:螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性。NaCl:提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。1.取约0.1g的水稻叶片在液态中磨成粉末，将适量的粉末材料转移至1.5mlEP管中。2.加入600µl预热（95℃）的1.5×CTAB缓冲液，然后65℃温浴20~60min。3.取出EP管，冷却后加入600µl氯仿:异戊醇（24:1）混合均匀，然后10000rpm离心10min，取出后吸取上清液到另一新的EP管中。4.加入2/3V异丙醇或2V无水乙醇混合均匀，冰浴至DNA丝状物出现。5.稍微离心沉淀DNA，倒掉上清液。6.加入600µl75%乙醇洗涤，放置30min。7.倒掉上清液，室温下吹干DNA。8.加入100µlTE溶解DNA。9.取5-10ul电泳检测提取效果10.-20℃下贮存备用CTAB法步骤注意事项1.所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。2.所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3.在提取过程，应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。DNA的质量检测电泳带型单一无拖尾现象点样孔无残留杂质OD值测定DNA纯品的OD260/OD280为1.8，若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。植物RNA提取分离RNA的目的RT-PCRNorthernblot构建cDNA文库GeneChips体外翻译RNA提取的关键--防止RNase降解RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。研究人员的手、唾液、灰尘、器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、各种试剂及各种组织和细胞中。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。1.耐高温的器具（如玻璃制品、研钵、剪刀、镊子等）于180℃下干烤8h2.塑料耗材（Tip、EP管等）用0.1%的DEPC水浸泡过夜，然后高压，再烤干备用3.实验用的氯仿、乙醇为RNA专用，水为DEPC处理水4.使用有效的RNase抑制剂：如异硫氢酸胍、RNasin5.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制6.实验过程需带一次性塑料手套且经常更换7.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。注意：DEPC有致癌之嫌，必须小心操作，防止接触与吸入！防止RNase污染的措施常用的RNase抑制剂DEPC(焦磷酸二乙酯):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。异硫氢酸胍∶目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。RNasin(RNA酶的蛋白质抑制剂）一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。1.胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀。2.氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。3.苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA。分离总RNA的方法TRIReagent提取总RNATRIReagent含有异硫氰酸胍和苯酚，能够有效溶解RNA，DNA和蛋白质。在加入氯仿并离心后，上层水相中含有RNA。水相的RNA经过沉淀和洗涤后几乎没有DNA或者蛋白质污染TRIReagent提取步骤1.研钵研杵预冷后,加入少量样品用液N迅速研磨成冰粉状2.将样品（样品量不超过100mg)移入1.5mlEP管中,迅速加入1mlTRIReagent混匀,室温静置5min3.加0.2ml氯仿,剧烈振荡15S,室温静置10min4.4℃,12000g,15min;取上清于另一EP管中，加0.5ml异丙醇混匀，室温静置10min5.4℃,12000g,8min；去上清，加1ml75%乙醇，涡漩沉淀6.去75%乙醇，室温晾干5~10min7.加30~50ulDEPC-H2O溶解8.电泳检测提取的RNA质量注意事项材料新鲜，冷冻材料切忌反复冻融，如要多次提取，分成多份保存（液氮长期保存，－70℃短期保存）先用液氮研磨植物材料，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮研磨后立即加裂解液裂解，样品与裂解液充分接触前避免融化样品量适当，保证充分裂解，样品量过多会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解在使用氯仿抽提纯化时，要充分混匀，动作快速RNA晾干时不要过干，会导致难溶实验过程必须严格防止RNsae的污染电泳试验吸光度测定保温试验质量分析电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，认为RNA的质量好的电泳试验吸光度测定保温试验质量分析280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般只看A260/A280（R）。R=1.8~2.0，说明提取的RNA可用，R1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNA的A260/A280的比值为2.0。电泳试验吸光度测定保温试验质量分析检测极残留的少量RNase污染按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000ng的RNA加入至0.5ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别，则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染植物蛋白的提取蛋白的制备1.选择材料和预处理2.细胞的破碎及细胞器的分离3.提取和纯化4.浓细、干燥和保存蛋白提取方法（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。蛋白提取方法我们实验室的方法(1)取100mg植物叶片,加提取缓冲液PBS1ml和少量石英沙研成匀浆，转移到1.5mlEP管中。(2)10,000g/min4度离心15min,取上清液放置4度冰箱备用。总蛋白的测定Bradford法：配制考马斯亮兰G-250蛋白显色液，其组成为：0.01％(w／v)考马斯亮兰G-250，4．7％(w／v)乙醇，8．5％(w／v)磷酸。以标准蛋白做蛋白浓度与OD值间标准曲线，取待分析的蛋白溶液于考马斯亮兰G-250显色液中，测其OD值，根据标准曲线即知待分析蛋白液中蛋白的浓度。讨论？1、样品不纯2、样品降解3、样品得率低4、样品电泳时检测不到条带一、DNA样品不纯1.DNA中含有蛋白、糖类、酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子1.重新抽提DNA，去除蛋白、糖类、酚类等杂质2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发后再溶解3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）原因对策二、DNA降解1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酶的活性3.提取过程操作过于烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.DNA反复冻融1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液；提取内源核酸酶含量丰富材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂含量3.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔4.所有试剂用无菌水配制，耗材经高灭菌5.将DNA分装保存于缓冲液中，避免复冻融对策原因1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.液氮研磨充分，适当延长裂解时间3.-20℃下低温沉淀；延长沉淀时间；加辅助物（NaAC或NaCl)，促进沉淀4.洗涤时要小心对策原因三、DNA提取量少四、RNA易降解1.样品不新鲜或样品保存不当，RNA降解2.污染了RNase1.尽量取新鲜样品，取后立即放入液氮中保存2.认真处理相应的器具和试剂，严格地操作原因对策五、RNA样品不纯1.抽提过程不彻底，存在蛋白等杂质的污染2.DNA的污