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《公共场所集中空调通风系统卫生规范》《公共场所集中空调通风系统卫生学评价规范》卫生微生物学指标与检测方法中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所王俊起范围《公共场所集中空调通风系统卫生规范》涉及到卫生微生物指标的条款包括：1、嗜肺军团菌（集中空调通风系统冷却水和冷凝水）2、细菌总数≦500cfu/m3真菌总数≦500cfu/m3β－溶血性链球菌等致病性微生物（集中空调通风系统送风）3、细菌总数≦100cfu/cm2真菌总数≦100cfu/cm2致病微生物（集中空调通风系统风管内表面）集中空调通风系统送风嗜肺军团菌的检测（——液体采样法）目的•控制由于空调通风系统造成生物致病因子经空气播散；预防危害人体健康，疾病传播的公共卫生问题发生；规范现场与实验室操作，为监督执法、预警预报提供准确的数据。准备与现场采样•1、采样设备、器材、试剂与培养基准备•2、现场调研、现场记录•3、采样人员无菌操作与个人防护•4、采样点的选择•5、采样无菌操作•6、气溶胶样品的采集（六级采样器）•7、水样品的采集•8、尘样品的采集•9、样品采集后的现场整理•10、样品采集过程中，人员的一般安全防护•Inadequateventilation（通风不当）52%•Contaminationfrominsidebuilding（建筑物内部污染）16%•Contaminationfromoutsidebuilding（建筑物外部污染）10%•Microbialcontamination(微生物污染）5%•Contaminationfrombuildingfabric（纺织品的污染）4%•Unknownsources（来源不明）13%影响室内环境（1、2、3、4、5）微生物污染的因素空调系统调查结果（引用）•新风量大室内空气质量高•新设备运行时空气质量优于老设备•清洁设备运行时空气质量优于污染设备检测生物性污染物对空调系统的污染与对室内空气质量的影响具有卫生学意义。空调系统的卫生微生物学检测不可能摆脱室内空气污染的规律与概念。认识1、室内污染来源占的份额高于室外。2、上述因素与空调系统均相关；但并不是说空调设备自身造成了室内空气污染；其危险与潜在的危害，是由于空调通风系统把人类的活动（工作、生活、爱好与环境等）造成的空气质量状态，进行了输送、转移、传播。空调给于了微生物一定的生存条件。3、空调系统的生物性污染除嗜肺军团菌外还有许多成员。如：目前国外有关室内空气真菌、空调系统所致真菌污染方面的研究日渐增多。4、环境对室内空气微生物存在极大影响（记录重要）。5、我们现行的规范要求包括了我们目前遇到的、可能遇到的生物性致病因子。指示生物与指标菌微生物在空气中的传播•名词解释：•气溶胶（aerosol）：是固态或液态微粒悬浮在气体介质中的分散体系。其微粒为微生物时，称之为微生物气溶胶。•液态粒子称雾；•小于1µm的固态粒子称烟；•大于1µm的粒子称尘。名词解释•气溶胶粒子大小：气溶胶粒子大小分布从0.001~100µm•微生物气溶胶粒子大小，从0.002~30µm。致病性生物因子•凡是在室内空气环境存在的致病性生物因子，都有可能通过空调系统播散，以致可能由于污染环境给人带来危险或潜在的危害。室内空气环境存在的致病性生物因子主要有如下几类室内空气环境存在的致病性生物因子：空气带菌粒子危害部位1、1~5的空气带菌粒子可直接侵入肺泡2、6~10的空气带菌粒子易沉着在小支气管3、10~30的空气带菌粒子会沉积在支气管微生物与粒子•1、空气中与疾病有关的带菌粒子直径一般为4~20µm。•2、来自人体的微生物主要附着在12~15µm的尘粒上。•3、许多真菌以单个孢子的形式存在。微生物•1、细菌类：结核杆菌、非结核杆菌、肺炎双球菌、嗜肺军团杆菌等160余种。•2、真菌类：球孢子菌、假丝酵母（念珠菌）、曲霉、毛霉、青霉等600余种。•3、病毒类：流感、水痘、风疹、腺病毒等约几百种。•4、其他：支原体、衣原体等。相关因素•空气中的微生物的存在和生存时间（存活力viability）与水环境、土壤环境的状况紧密相关，微生物本身的特征起主导作用。研究微生物的生境是重要的工作内容。特点依据实验研究，空气中的微生物如果不能回到有利于其生活和繁殖的环境中，迟早是要死亡的。微生物几乎全部是附着在尘埃上，尘埃并不全部有微生物的附着；灰尘量与菌数并不呈现线性正相关。不同的采样方法所捕获的带菌粒子也不相同。趋势强毒力、高传染性微生物气溶胶的研究•兔热杆菌：志愿者15个左右的菌即可；军团菌：气溶胶中检出即对人有感染。•日本乙型脑炎病毒、裂谷热病毒、拉沙热病毒、出血热病毒、与畜牧业新城疫、流感等。•真菌、真菌毒素。方法学中的问题1、空调系统与室内空气质量的相关性2、不同的采样方法所获得的结果有差异3、样品处理方式、操作不一致影响结果的一致性4、注意样品处理过程的一致性指示生物的选择•肠道指示生物为例（N条）：肠道独有，代表性强数量多存活时间比致病菌稍长对消毒剂的耐受性比致病菌稍高对人危害无或很小检测方便，程序简单指示生物大肠杆菌作为水污染与否的卫生指示生物应用多年，行之有效，各界公认，基本符合指示生物的多项要求。对于室内空气而言，指示生物则难以被选出。大肠杆菌作为粪便污染的指示生物，与肠道传染病的病原体不仅同原，还存在诸多共性，有代表性。空气则无法找到这么一个指示生物。所以对空气质量的认同，我们选择了指示生物与致病生物监测两个途径。指示生物的目前选择•细菌总数、真菌总数、溶血性链球菌、嗜肺军团杆菌等等检测方法的论述采样样品保存与运输•1、带培养基的样品•2、一般水、土样品•3、分离军团菌的样品•4、培养基的运输与保存（时间、温度、避光）（防污染、防增殖、防消亡、防破损、防乱号）注意事项1、采样：气体：（以时间确定）仪器法。尘量：适时评估确定方法（擦拭、刮拭）。2、培养基检查有无污染3、培养时间相关的问题（菌数多少、湿度保证、温度控制）4、采样点的选择5、关注采样环境采样与检测方法1、对室内空气常用的采样方法有：自然沉降法（曝皿法）（本稿不采纳）空气微生物采样器法：推荐撞击式6级空气微生物采样器2、液体过滤、冲击采样：采集室内空气军团菌时应用3、管道：擦拭法、刮拭法采样——人工•擦（棉）拭法：布、棉花或其他材料，通常用灭菌盐水润湿，通过擦拭采取通风管道表面的微生物；然后在同样的溶液洗脱微生物，并涂平板培养与计数菌落形成单位以供分析，涂板方法可用湿拭子直接涂布，也可以用洗脱液涂布。在无法进行机械采样的风管中应用。•刮拭法：尘量多、板结、粘稠时使用采样——机器人人工采样受到多方面的影响，一致性不高，难完成规范要求的任务；机器人采样同一性高；能满足规范要求的工作内容；目前品种较少，通风管道没有标化：•符合规范要求•按产品说明书的要求操作•注意质控采样与检测方法•直接的灰尘培养：从空调通风管道表面取得灰尘，直接悬浮于0.01%吐温80（PBS或生理盐水）溶液中，然后稀释并选择适宜稀释度，取1mL按倾注法操作，培养与计数菌落形成单位以供分析。尘量大需要秤量。检测方法的论述•细菌总数细菌总数•细菌总数定义：•仪器法采集室内空气，计数在营养琼脂培养基上经37℃48小时培养所形成的菌落数，换算为每立方米室内空气中菌落总数，以cfu/m3（colonyformingunits/m3）每立方米室内空气菌落形成单位报告。•管道尘的稀释倾注法：检测管道尘中的细菌总数依Xcfu/cm2报告。细菌总数的检测细菌总数的检测细菌总数的检测细菌总数的卫生学意义•空气没有提供作为细菌和它种微生物生长所需要足够的水分与营养物质，所以空气不是微生物产生与繁殖的场所，检测出空气中存在微生物，主要来源于外环境（包括植物在内）与人、动物的活动。某一种或几种致病性微生物存在的内在原因，即是人、畜污染所致，致病微生物的存在，对生活之中的人们就可能构成了潜在的危险，在条件适宜的情况下造成疾病的传播。一般说，室内空气质量在适宜微生物贮留与生长繁殖的场所，与换气量不足、通风不良、人员较多时，就造成微生物数量的增加。虽然单纯微生物种类与数量的多寡，不能说就一定引起人们的疾病，却可以有不舒适的感觉。室内空气标准制定的情况•苏联：规定夏季清洁空气为细菌总数＜1500cfu/m3、污染空气为细菌总数＞2500cfu/m3；而冬季清洁空气细菌总数＜4500cfu/m3、污染空气为细菌总数＞7000cfu/m3。室内空气标准制定的情况•日本：日本采用自然沉降法统一用直径9cm平皿:将室内空气分为5级：•清洁＜29、•普通30－74、•可接收界限75－149、•轻污染150－299、重污染＞300。室内空气标准制定的情况我国：•医院：撞击法＜2500cfu/m3沉降法＜30cfu/皿。•公共场所撞击法4000cfu/m3；沉降法45cfu/皿。•香港特别行政区（制订“办公室及公众场所室内空气质素管理指引”，指明微生物污染物包括三大类，细菌、真菌、过滤性病毒。）空气中细菌标准是，一类＜500cfu/m3，二类＜1000cfu/m3。空调通风管道表面细菌浓度•在空调通风管道表面细菌浓度，在3.2×105～1.5×106cfu/g之间。一般情况下，微生物浓度增加的一些因子包括潮湿条件与空气回流。在空调通风管道表面细菌污染一般情况下低于旋转热交换器（107cfu/m2）、冷却管或加湿器（107cfu/m2）。有资料表明，灰尘表面浓度对可生存的微生物浓度影响小，沉积于空调通风管道表面后再形成生物气溶胶的菌存活时间一般较短，有待于更多的实验与检测数据证实。室内空气标准制定的情况•实验资料：人群聚集80min空气中细菌数，沉降法44cfu/皿，撞击法4300cfu/m3。在撞击法细菌总数4000cfu/m3，沉降法33cfu/皿，CO20.08％浓度时，有异臭感和不适感者为24.1％；在撞击法细菌总数6000cfu/m3，沉降法75cfu/皿，CO20.15％浓度时，有异臭感和不适感者出现率为55％。采样方法与要求采样时必须在空调系统正常运转条件下，关闭门窗（参考时间30分钟），尽量减少人、畜的活动幅度与频率，记录采样位置、室内人员数量、温湿度与天气状况等。采样方法与要求•采样应用营养琼脂培养基，37±2℃培养48±4小时，观查并记录结果（37℃培养24h时应进行观查，不必记录结果）。采样方法与样品处理要求•空调系统管道：无菌操作准确称取管道尘（记录数量），加入到含有0.01%Tween-80的0.03mol/LPBS中，作10倍梯级稀释，视灰尘含菌量多少选三个数量级的稀释液，各取1mL稀释液直接加入平皿中，用营养琼脂培养基作混碟培养。37±2℃培养48±4小时，观查并记录结果（37℃培养24h时应进行观查，不必记录结果），其所得菌落数乘以稀释倍数，换算cfu/cm2细菌总数。采样方法与要求空调送风：依监测目的和应用方法确定采样点，选择仪器法采样一般在送风口下方15～20cm距离50～100cm处；室内空气：采样点的高度为1.2m。不同采样方法所获得的结果不一致，报告结果时应注明采样方法。培养基的制备•成分：蛋白胨10g•氯化钠5g•肉膏5g•琼脂20g•蒸馏水1,000ml•制法：将上述成分加热溶化于蒸馏水中，校正pH值为7.4~7.6。加入琼脂，121℃20min灭菌。•用途：供空气细菌总数检测用。含0.01%Tween-80的0.03mol/LPBS•磷酸氢二钠2.83g•磷酸二氢钾1.36g•蒸馏水至990mL•Tween-80最终浓度0.01%•方法：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾溶于少量蒸馏水中，溶解混匀加水至990mL，按比例加入1%Tween-80液10mL，使最终浓度0.01%，121℃蒸汽灭菌20min。注意点•1、采尘样条要浸泡在转运液体中。•2、稀释与取样时充分洗脱，操作一致•3、进口安德森采样器的应用：注意平皿中琼脂的厚度检测方法的论述•真菌总数：仪器法采集室内空气，计数在沙氏琼脂培养基上经28±2℃培养5天培养所形成的菌落数，换算为每立方米室内空气中