乳酸生产中的微生物代谢工程

第6卷第3期过程工程学报Vol.6No.32006年6月TheChineseJournalofProcessEngineeringJune2006收稿日期：2005−07−14，修回日期：2005−09−26基金项目:国家重点基础研究发展计划(973)资助项目(编号：2003CB716007)作者简介：王海燕(1981−)，女，内蒙古包头市人，硕士研究生，研究方向：生物化工；刘铭，通讯联系人，E-mail:[e-mail].乳酸生产中的微生物代谢工程王海燕1,2，刘铭2，王化军1，曹竹安2(1.北京科技大学环境工程系，北京100083；2.清华大学化学工程系，北京100084)摘要：从代谢工程的角度综述了同型及异型乳酸发酵的代谢途径、乳酸菌代谢模型、乳酸脱氢酶在乳酸生产方面的应用、米根霉发酵生产乳酸的代谢工程和基因工程阻断乙醇代谢途径改造乳酸的生产过程等方面的研究进展，讨论了生物信息学及环境胁迫对乳酸代谢的影响，展望了乳酸的微生物代谢工程的发展趋势.关键词：乳酸；微生物生产；代谢工程中图分类号：Q93文献标识码：A文章编号：1009−606X(2006)03−0512−051前言乳酸[1](Lacticacid)在食品、医药、化工、环保等领域有广泛的用途.微生物发酵法生产乳酸具有原料来源广泛、生产成本低、产品光学纯度高、安全性高等优点而成为乳酸的主要生产方法.目前可以应用到工业上的生产菌株主要有霉菌中的根霉属和细菌中的乳酸菌属.按微生物发酵糖类过程中代谢途径和产物的不同，可将乳酸发酵分为同型乳酸发酵(Homofermentation)、异型乳酸发酵(Heterofermentation)和混合酸发酵(Mixedacidfermentation).通过化学或物理诱变改善生产菌株的工业性能是发酵工程的基本思路[2].传统的育种手段虽然在工业应用上是有效的，但由于突变的非定向性和设计的非理性，以及对微生物代谢特性的认识不足，妨碍了对微生物代谢能力的改造及工业应用.重组DNA技术的发展使代谢工程应运而生.代谢工程是利用重组DNA技术或其他技术，有目的地改变生物中已有的代谢网络和表达调控网络，以更好地了解细胞的代谢途径，并用于化学转化、能量转移及大分子装配过程.本工作对乳酸生产的代谢工程的研究进展进行了分析，并提出了展望.2乳酸代谢途径及其特点2.1同型乳酸发酵菌同型乳酸发酵中乳酸是葡萄糖代谢的唯一产物，采用的是糖酵解途径(Embden−Meyerhof−ParnanParthway,EMP途径)[3−5]，见图1.经过这种途径，lmol葡萄糖可生成2mol乳酸，理论转化率为100%.但由于发酵过程中微生物有其他生理活动存在，实际转化率在80%以上的即认为是同型乳酸发酵.同型乳酸发酵的微生物主要有德氏乳杆菌和粪链球菌.同型乳酸发酵代谢途径的特征是1,6−二磷酸果糖在1,6−二磷酸果糖醛缩酶的作用下生成磷酸二羟基丙酮和3−磷酸甘油醛，发酵1mol葡萄糖生成2mol乳酸和2mol三磷酸腺苷(ATP).在进入酵解之前，单糖如葡萄糖和果糖一般都要进行磷酸化，并且由磷酸转移酶系统(PhosphotransferaseSystem,PTS)使单糖转移进入细胞.一些乳酸菌如Streptococcusthermophilus则是在乳酸透性酶运输系统的作用下进入细胞进行水解和磷酸化.图1同型乳酸发酵代谢途径Fig.1ProposedpathwayforhexosemetabolismofhomofermentativelacticacidbacteriaPTSPTSPTSFructoseGlucoseMannitolGlucose-6-pFructose-6-pMannitol-1-pFructose-1,6-di-pGlyceraldehyde-3-pDihydroxy-acetone-p3-p-glyceratePhosphoenolpyruvatepyruvateLactateAcetyl-CoAEthanolAcetateAcetolactateAcetoin2,3-ButanediolDiacetylMannitolNADH+H+NAD+PiATPADPADPATPNAD+NADH+H+ADPATPCoANAD+NADH+H+CO2NADH+H+NAD+2NADH+H+2NAD+NAD+NAD+NADH+H+NADH+H+ADPATPCO2O2FormateCoAPi第3期王海燕等：乳酸生产中的微生物代谢工程5132.2异型乳酸发酵菌异型乳酸发酵经由磷酸戊糖途径(HexoseMonophosphatePathway,HMP)生成等摩尔的乳酸、二氧化碳和乙醇(或乙酸)，其中产物乙醇和乙酸的比例取决于微生物中的氧化还原作用.进行异型乳酸发酵的主要有乳脂明串珠菌、发酵乳杆菌、肠膜明串珠菌、短乳杆菌、双歧杆菌[6,7].异型乳酸发酵菌缺乏1,6−二磷酸果糖醛缩酶，因而利用6−磷酸葡糖酸/磷酸酮酸途径进行己糖发酵，见图2.在厌氧状态下，葡萄糖转化为乳酸、乙醇和二氧化碳，1mol葡萄糖发酵得到1mol三磷酸腺苷.乙酰基磷酸转化为乳酸取代乙醇，这样额外的ATP就会生成，NAD+则可通过选择性的电子受体获得.在好氧的状态，氧可以成为电子受体.图2异型乳酸发酵代谢途径Fig.2Proposedpathwayforhexosemetabolismofheterofermentativelacticacidbacteria3乳酸菌代谢的研究3.1乳酸菌中的关键酶乳酸菌(LacticAcidBacteria,LAB)是一类非常重要的工业微生物，在食品发酵中应用的历史非常悠久，全世界每年用于奶酪和酸乳发酵工业的乳酸乳球菌细胞约有50万吨.近年来，由于乳酸乳球菌可作为“细胞工厂”来生产食品和药物而更加受到关注[8].可以预期，乳酸菌代谢工程的发展将为发酵食品工业创造新的发展机遇.通过糖分解代谢将糖转化为乳酸是革兰氏阳性菌和乳酸菌中主要的代谢途径[9]，并且乳酸菌由于其基因组很小，遗传背景清楚和代谢途径简单等特点而成为模式菌株.乳酸菌合成乳酸的代谢途径很早就受到了关注，国内外在乳酸脱氢酶及其代谢途径改造方面开展了大量研究工作.乳酸脱氢酶(LactateDehydrogenase,LDH)以NADH为辅酶，能将丙酮酸转化为乳酸，是乳酸菌合成乳酸过程中的关键酶.在产D,L−乳酸的乳杆菌中存在依赖于NADH的D−乳酸脱氢酶和L−乳酸脱氢酶，分别催化丙酮酸生成D−乳酸和L−乳酸.传统的菌种改良主要通过诱变筛选的方法提高乳酸的产量，在底物与产物耐受条件的筛选中得到昀大乳酸产量为195.5g/L的菌种[10]，但选择更高乳酸产量的菌种仍需要通过遗传工程与基因工程的改造来完成.LactobacillushelveticusCNRZ32[11]是一种可以表达D−乳酸脱氢酶和L−乳酸脱氢酶的乳酸菌，并且分别产生D−乳酸和L−乳酸.用基因替代的方式构建了2株菌GRL86和GRL89，其中GRL86菌株缺失了ldhD的启动子区域；GRL89菌株不仅缺失了ldhD基因，并且增加了L−LDH基因的拷贝.结果发现这2个突变株仅能生产L−乳酸，在产量上与原始菌株相同，L−LDH的活性分别比原始菌株高出53%和93%.此外，GRL89的L−乳酸产量还可以根据实验数据利用响应面法进行优化.菌株GRL89的乳酸产量比GRL86高出20%.LactobacillusjohnsoniiLa1[12]是一种益生菌，生长在牛奶中，将乳糖以3:2的比率分别转化为D−乳酸和L−乳酸.将D−乳酸脱氢酶基因从细胞中分离出来，敲除长度为8bp的基因片断使其功能失活，再通过同源重组的方式转入细胞.结果表明，改良后的菌株中L−乳酸脱氢酶的活性有所降低，但仍然能充分地将丙酮酸转化为L−乳酸，而次级代谢产物仅有少量增加.乳酸脱氢酶可以有效地控制丙酮酸的代谢流，并产生NAD+，因此代谢途径转向次级代谢产物生成的可能性较小.李剑等[13]筛选到一株产D,L−乳酸的乳杆菌(Lactobacillussp.)MD21，能在48℃含200g/L葡萄糖的发酵液中快速生长并生产乳酸，72h产量可达140g/L以上；并且初步分析了乳酸脱氢酶的序列及编码蛋白质的一级结构，对其功能进行了鉴定.3.2代谢模型昀近糖代谢途径的模型已经建立，并且提供了人机GlucoseFructoseMannitolGlucose-6-pFructose-6-p6-P-gluconateRibulose-5-pXylulose-5-pGlyceraldehyde-3-pAcetyl-pAcetateAcetyl-CoAEthanol3-P-glyceratePhosphoenolpyruvatePyruvateLactateNADH+H+NADH+H+NADH+H+NADH+H+2NADH+H+NADH+H+2NAD+NAD+NAD+NAD+NAD+NAD+ADPADPADPADPADPATPATPATPATPATPPiCO2CoAPi514过程工程学报第6卷对话版本.该模型可以有效地应用于代谢工程策略的设计，因为它可以预测野生型菌株和突变株的发酵数据和代谢过程中的影响因素以及代谢产物的变化，因此可以用来优化发酵过程，预测由于酶活的变化和发酵条件的改变而对代谢产物的影响.此外，该模型还可以预测代谢中间产物的代谢途径，例如磷酸己糖等；也可以定性地预测底物、中间产物及酶的变化，但还不能做到定量描述糖消耗途径中各种物质的变化.代谢网络是一个大的分支系统，它所涉及的不仅仅是碳的代谢过程，同时也要经过氧化还原和能量交换过程.在这样一个复杂的代谢网络中，一个孤立的方法想得到目标产物是不太可能的，应该用综合的思路对乳酸代谢进行研究.如今一些理论如生物系统、代谢控制分析(MetabolicControlAnalysis,MCA)和代谢设计，已经揭示出了多酶系统并进行了量化.在代谢控制分析中，代谢控制系数(Flux-controlcoefficient)可以量化代谢过程中各种酶的催化能力[14]，并可以阐明引起酶活性变化的原因.Hoefnagel等[15]综合利用动力学模型、代谢控制分析、实验分析方法对乳酸菌进行了代谢工程的研究，以丙酮酸的代谢途径作为研究的模型.代谢控制分析说明在乙酰乳酸的途径中每个酶对代谢流的控制都是重要的，因此认为酶的流量控制系数昀大.LDH具有昀高的流量控制系数，通常认为敲除LDH可能会使更多的碳进入乙酰乳酸支路，然而实验表明只有11%的碳进入这条支路，低于模型预测的数值；主要的产物是3−羟基丁酮，这与模型预测一致.此外，NADH氧化酶(NOX)也具有很高的代谢控制系数，模型预测如果NOX的表达超过40倍就会有20%的葡萄糖进入乙酰乳酸合成酶(AcetolactateSynthase,ALS)支路，然而只有13%的葡萄糖转化为3−羟基丁酮.敲除LDH基因并结合过量表达的NADH氧化酶被认为会有更强的效果，同时模型预测将有92%的丙酮酸进入到ALS途径，但结果显示，相比于只敲除LDH基因的菌株，其产量没有明显的提高.模型的建立可以使实验数据一体化、系统化，可以增加我们对实验设计的感性认识，可以处理数据并预测代谢流向.但动力学模型不能处理更多变量，应综合利用动力学模型、MCA等方法，在实验中加入更理性的设计策略，优化目标产物的代谢途径.4米根霉发酵生产乳酸的代谢工程Rhizopusoryzae是工业发酵中一种重要的生物，作为好氧真菌[16−18]，它是依靠呼吸产能并提供合成菌体的中间产物，其发酵属混合酸发酵.它经由EMP途径生成丙酮酸，然后进入三羧酸循环，副产物是丙酮酸、延胡索酸或其他一些有机酸.由于它能在低营养状态下将淀粉直接转化为单一的L−乳酸，在乳酸生产中具有一定的优势[19].因为L−乳酸的产量是建立在总碳水化合物消耗的基础上，所以其产量比较低.传统的物理、化学等方法可以成功地用于改善真菌的代谢及酶的生产能力.如Lo