一株蝗虫病原菌的分离鉴定及其毒力研究

一株蝗虫病原菌的分离鉴定及其毒力研究【摘要】：从蝗虫自然病死虫尸中分离到一株病原菌HR-3，其纯培养物的致病性被科赫原理证明；从内地黄脊竹蝗自然病死的虫尸内分离到一种病原菌，其纯培养物经KOCK病症律证明，并按《伯杰细菌鉴定手册》（第九版）的方法进行了生物学鉴定、生理生化实验，并测定了其DNA中G+Cmol含量为63.73%，确定该病原物为类产碱假单胞菌（Pseudomonaspseudoalcaligenes）。为确定该菌在分类学上的地位，经生理生化测定和分子鉴定，此病原菌为粘质沙雷氏菌（Seerratiamarcescens）。通过口服感染测定了该菌对蝗虫的毒力，毒力回归方程为y=1.067+0.809x，致死中浓度LC50=1.164×108cfu/ml。为探讨HR-3对蝗虫致病的作用机理，对HR-3感染蝗虫后的组织病理进行了研究，结果表明感染初期蝗虫的中肠上皮细胞受到破坏，继而出现局部变性坏死。感染48h后，消化细胞层大部分区域被空泡状物充盈。【关键词】：类产碱假单胞菌，粘质沙雷氏菌，鉴定，毒力，病理，蝗虫【Abstract】：fromthelocustsnaturaldeathwormresinseparationtothestrainsofpathogenicbacteriainHR-3,thepureculturesofpathogenicbyKochprinciple;Fromthemainlandhuangridgebamboolocustnatureanddeathoftheinsectintheresinseparationtoapathogen,KOCKdiseaselawhasprovedthatthepurecultures,andpress\bergerbacteriaidentificationmanual\(ninthedition)methodtocarryonthebiologyidentification,physiologicalandbiochemicalexperiments,andthedeterminationoftheDNAG+Cmolcontentis63.73%,determinethediseaseoriginalobjectfortheclasstoproducealkaliPseudomonas(Pseudomonaspseudoalcaligenes).physiologicalandbiochemicalandmolecularidentificationofthepathogenofserratiamarcescens(Seerratiamarcescens).Withoralinfectiontodeterminethebacterialvirulenceoflocusts,virulenceregressionequationfory=1.067+0.809x,lethalconcentrationLC50=1.164x108cfu/ml.TostudytheroleofHR-3oflocustsandpathogenicmechanismoftheHR-3infectionafterlocustshistopathologicarestudied,theresultsshowthatearlyinfectionoflocustsinintestinalepithelialcellsweredamaged,andthenalocaldegenerationnecrosis.Infectionafter48h,digestivecellsmostfloorsarefilledwithairbubbles.【Keywords】：pseudomonasclassproductionbase,serratiamarcescens,appraisal,virulence,pathology,locusts蝗虫属于直翅目（Orthoptera），蝗科（Locustidae）的昆虫，是一种世界性的有害昆虫，在我国全国性分布和危害，给农牧业带来巨大的经济损失[1]。尤其以北方最为严重，在北方草原，以其“种类多、数量大、分布广、危害重”等特点成为草地第一害虫[2]。仅以北方草原和青藏高原草地，每年发生并危害的面积近1000万公顷，严重危害牧草生长，是草地产草量下降30—70%[3]，造成巨大的经济损失。近年来，我国蝗区范围扩大，发生面积增加，暴发频率提高，对农业生产构成了严重威胁。“九五”期间，全国飞蝗［Locustamigratoriamanilensis(Mey)］发生面积累计达1.2亿亩次，特别是2000年飞蝗发生涉及12个省市区的160个县，发生总面积超过3000万亩次。据专家分析，蝗虫发生呈现不断加重趋势[4]。蝗虫的防治已成为一项非常紧迫的任务。随着化学杀虫剂大量而长期的使用所暴露出的许多缺点，作为一种防治农林害虫的新技术手段，微生物农药在世界范围内受到广泛重视[5]。在害虫的生物防治中利用昆虫的病原微生物便是很重要的一部分。蝗虫微孢子虫是我国研究生物防治方法控制蝗害的第一个成功例子，但是由于其历时长，不能短时间控制大规模发生的蝗灾。利用昆虫病原真菌包括白僵菌、绿僵菌和黄绿僵菌等开发的真菌灭蝗制剂经过田间实验也显示出良好的发展势头。1991年，刘世贵等从重庆市歌乐山林场黄脊竹蝗自然死亡虫尸中分离鉴定出蝗虫病原菌—类产碱假单孢菌（Pseudomonaspseudoalcaligenes)，并研制成“细菌灭蝗剂”，在草原使用取得了较好的灭蝗效果[6]。2004年，金虹等又从自然死亡草地蝗虫尸体中分离到蝗虫病原菌—粘质沙雷氏菌（Seerratiamarcescens）[7]。2004年陶勇等从土壤中分离到对蝗虫有较高致死率的几丁质酶产生菌C4[8]。本文从一自然病死的周身发红的蝗虫虫尸中分离得到一种病原菌，经回复感染蝗虫，能引起蝗虫致病并死亡，并且从虫尸中分离到同样的病原菌，证明该病原菌为蝗虫自身的致病菌，对该病原菌进行了菌种鉴定和初步的毒力及病理学研究。[1]刘举鹏，浅谈我国一些重要代表性蝗虫[J].生物学通报，1996,31（10）：8—10[2]刘世贵，四川大学学报，1992.29:2—8.[3]李克夫，马耀，杜文亮。中国草地，1992，(1):50—52.［4］赵文臣.防治蝗虫问题的反思.科技交流，2000，10：32—34.[5]赵文臣，防治蝗虫问题的反思[J].科技交流，2000.10:32—34.[6]刘世贵，袁兴，朱文，等.一株蝗虫病原菌的分离和鉴定[J].微生物学报.1995.35(2):86—90.[7]金虹，葛绍荣，刘世贵，等.一株蝗虫病原菌的分离鉴定及其毒力和病理研究[J].微生物学报.2005.45（2）：172—176.[8]TAOYong,LONGZhang-fu,LIUShi—gui.etal.IdentificationofaChitinase—producingBacteriumC4andHistopAtholodicStudyonLocusts[J].PestManagementScience.2005.61:159—165.1.材料和方法1.1菌种来源和供试昆虫病原菌HR—3分离自一自然病死的周身发红的蝗虫虫尸。供试蝗虫采自四川省盐源县草地和蒲江县等地，虫龄为2—3龄，虫种为宽须蚁蝗[MyreleotettixPolpalis(Zub)],试前在室内观察3—4d后作感染用。1.2试剂Taq酶购自.TaKaRa公司,pGEM-T载体购于Promega公司，其它生化试剂均为国产分析纯。1.3培养基肉汤胨培养基：每升含牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂18—20g，PH7.4—7.6，121。C灭菌30min。发酵培养基：每升含蔗糖10g，蛋白胨20g，NaCl3g，PH7.4—7.6，121。C灭菌30min。生理生化鉴定培养基［3］!1.4病原菌分离和回复感染试验[4]将采集自田间一自然死亡的周身发红的蝗虫尸体浸入70%乙醇2s，消毒体表后，无菌条件下将其已腐烂的内脏制成匀浆，用无菌水稀释至适当浓度，涂肉汤胨平皿，28。C培养24h，挑取单菌落。将纯化后并经摇瓶发酵的菌悬液（109个/ml）喷洒到玉米苗上，舔食感染2—3龄蝗虫。每天观察记录染病蝗虫的症状。收集死虫，并进行病原菌分离，方法同前。1.5形态观察1.5.1菌落形态观察：纯化的菌株接种于肉汤胨平皿上，28。C培养48h后观察生长情况及菌落特征。1.5.2细胞显微形态观察：扫描电镜标本采用临界点干燥标本，其制备方法参照文献［5,6］。用JSM-840扫描电镜在加速电压10-15kV下观察。1.6生理生化试验参照文献［3,7］的方法进行。1.716SrDNA的PCR扩增和产物测序取对数生长期新鲜菌液，离心收集细菌，按文献［8］的方法提取基因组DNA。依据细菌16SrDNA中最保守的序列设计引物，由北京赛百盛基因公司合成。正向引物：5’．ATGGATCCGAGAGTrrGATCCTGGCTCAG一3’；反向引物：5’一TATCTGCAGTGGTGTGACGGGCGGTGT一3。PCR反应体系(50UL)：10×PCR缓冲液(Mg++)5pL，dNTPs(10mmol/L)1UL，混合引物(10umol／L)2uL，模板DNA2．5ul，Taq酶(5U／uL)0．5ul，ddH2039ul。PCR反应条件：94℃，4min；94℃，1min，55℃，1min，72℃，1min，共30个循环；72℃，10min。PcR扩增产物经纯化后克隆进入pTA2．T载体，送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。1.8系统发育分析测序得到1428bp的16SrDNA序列。结果输入核酸数据库（RDPII）［9］进行序列比较，将与之同源性最高的14株细菌模式株的16SrDNA序列，采用DNAMAN5.2软件的MultipleSequenceAlignment进行16SrDNA同源性分析，并构建系统发育树，发育树的构型和稳定性用DNAMAN5.2软件取样分析1000次，进行Bootstrap值分析和评价。1.9毒力测定田间采集健壮且个体大小基本一致的蝗虫，菌液（109个/ml.）用无菌水稀释至适当浓度，共设5个测试浓度，每个浓度试虫20头，设3次重复，空白对照用无菌水。口服处理后蝗虫放于特制纱笼中，48h后进行检查，统计死虫数，进行统计分析［10,11］，采用统计分析软件SPSS(V11.0)，以校正死亡率值法求毒力回归方程。1.10蝗虫感染该病原菌后的组织病理变化［12,13,14］用分离到的病原菌培养液对供试蝗虫进行滴口感染，以无菌水为对照。分别从菌液处理后12h、24h、48h的蝗虫中取样解剖，取中肠组织浸于固定液中。正常对照于24h后从对照组（无菌水滴口）中取样。按常规石蜡切片方法进行洗涤、脱水、透明、渗蜡、包埋、切片、粘片、染色等操作程序，将封好的玻片在普通光学显微镜下观察并拍照。2结果2.1回复感染和病死虫特征根据科赫病症律，用分离的病原菌HR-3纯培养物回复感染2-3龄蝗虫，蝗虫于24h后开始死亡，72h达到死亡高峰，幼虫感病后行动迟缓不活跃，基本停食。死亡后躯体逐渐变红，挤出的液体呈红色并有臭味。回复感染原宿主后的病死虫病症与以前相同。并从回复感染致死的虫尸中重新分离到了相同的病原菌，确证U+1为致死蝗虫的病原菌。2.2菌体细胞形态和培养特征HR-3细胞呈短杆状，菌体长1.19-1.77um，宽1.08-1.20um，无芽胞（图1）。在肉汤平皿上培养48h后菌落呈圆形，光滑湿润，边沿整齐，表面隆起，菌落红色。图1HR-3扫描电镜图(7000X)2.3HR-3的生理生化特性鉴定结果（表1）表明，HR-3为革兰氏阴性，兼性好氧；V-P(Voges-Proskanerreaction)过氧化氢酶反应阳性；M.R(MethylRedtest，甲基红试验）、氧化酶、