一株进口痘病毒疫苗株整合序列的研究

1一株进口痘病毒疫苗株整合序列的研究高明超1*，陈静3，张志2**，杜元钊3***，刘秀梵1（1.扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室;江苏扬州225009；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032；3.青岛易邦生物有限公司，山东青岛266032）摘要：本文根据禽痘病毒(FPV)基因组中禽网状内皮组织增生症病毒(REV)常见整合区域的序列设计合成的一对引物，对国外一株疫苗进行了PCR扩增，结果扩增出一条1478bp的片段，经过测序和序列分析表明该片段为REV和FPV的整合序列，痘病毒序列中整合了大小为193bp的REV长末端重复序列，进一步比较显示该序列与国外REV毒株APC566、713和SNV的同源性分别为：99.6％、98.0％和87.3％，与我国REV分离株HA9901的同源性只有83.6％。同时该REV整合序列与国外已经测定的痘病毒毒株AJ581527、AY255633、AF198100、AF006064和AF246698比较时发现，这些毒株中含有的REV序列不仅完全一致，而且REV序列的插入位点也完全相同。这说明国外痘病毒疫苗中不仅含有REV整合序列，而且已经存在多年了。关键词：痘病毒，网状内皮组织增生症病毒，重组株，整合近年来关于鸡痘病毒（Fowlpoxvirus,FPV）基因组中整合有网状内皮组织增生症病毒（ReticuloendotheliosisVirus,REV）序列的报道不断增加，研究者们开始关注这种不同科属病毒间的基因重组[1]。美国、澳大利亚等不同地区都陆续报道了鸡痘病毒和鸽痘病毒中整合有网状内皮组织增生病病毒序列，不仅疫苗当中整合有REV的LTR片断或是REV全基因组序列，而且野毒株中也几乎含有REV的前病毒全基因序列[2-3]。更有报道认为这种现象早在50年前就已经发生了[4]。已有研究证实，随着FPV和REV的不断繁殖和演变，这种整合变得更普遍、更稳定,也说明这种整合对于痘病毒的增殖和感染都是有益的[5]。而且这种整合对FPV的生物特性产生很大影响，其中最明显的表现为FPV疫苗保护力的下降；野毒致病力的增强等[5]。我国的研究者也发现不仅分离的野毒株中含有REV的前病毒基因序列，而且国产疫苗当中也整合有REV的LTR序列[6-7]。我国目前市场上出售的痘病毒疫苗种类多样，既有国产的疫苗，也有进口的疫苗，面对痘病毒疫苗免疫效果不理想的现状，我们一直担心这种状况是否与痘病毒疫苗中携带REV部分序列片段有关，也一直在努力寻找不带有REV基因序列的“纯”痘病毒疫苗，在此过程中我们意外地发现一株进口疫苗的基因组中也携带REV基因序列，本文此疫苗为研究材料进行了进一步的研究，以期更深入地了解REV整合入痘病毒疫苗的机制、对痘病毒疫苗的影响及其整合意义。1材料和方法1.1材料SPF鸡胚购自于山东济南斯帕法斯公司，自行孵化。鸡胚成纤维细胞按常规方法制备。MEM购自于Hyclone公司，小牛血清购自于上海塞达公司。蛋白胨和酵母抽提物购自于英国OXOID公司；禽痘病毒疫苗：AvianEncephalomyelitis-FowlPoxVaccineLiveVirus疫苗购自MERIAC公司。.*作者简介：高明超（1981－）,男，硕士，Email:[e-mail]**通讯作者：张志（1976－），男，博士，Email:[e-mail]***责任作者：杜元钊（1965-），男，研究员，Email：[e-mail]21.2疫苗的处理与病毒的繁殖将购买的AvianEncephalomyelitis-FowlPoxVaccineLiveVirus疫苗用5ml灭菌PBS液稀释。取0.1ml疫苗稀释液接种已长满的鸡胚成纤维细胞（CEF）单层上，置5%CO2，37℃培养箱中培养，待细胞传代至出现典型的FPV病变时收取细胞毒。同时用国内的一株痘病毒疫苗毒和一株REV毒株HA9901接种CEF做阳性对照，未接种CEF作为阴性对照。1.3细胞DNA的提取接种出现FPV病变后，加入胰酶消化，离心，用PBS洗一次，加入组织抽提缓冲液（100mmol/LNacl,25mmol/LEDTAPH8.0,10mmol/LTris-clPH8.0,0.5%SDS）和100μg/ml蛋白酶K，52℃消化过夜后，用等体积的苯酚：氯仿抽提一次，再加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的乙酸钠（3MPH5.2）沉淀，用70%的乙醇洗涤一次，自然干燥，加80µl的TE溶解，-20℃冷冻保存。阴阳性对照的处理与此类似。1.4PCR扩增根据国外发表文献，以最容易发生病毒整合的痘病毒基因组201和203蛋白序列区域设计合成了一对引物：上游201F：5‘-CCACCGGTATATCATGCGTCTTGAAAG-3’下游203R：5‘-CGTGTTCAGAAGATTGTAGAGAACG-3’PCR的反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃1min，57℃2min，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5测序和分析利用上述引物分别以美国FPV疫苗毒株和一株国产FPV疫苗株感染CEF提取的细胞DNA为模板按上述反应条件扩增，用回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司）回收PCR产物，然后与pMD18-T载体连接、转化，经过蓝白斑筛选，挑选阳性克隆测序，并对测序结果进行序列分析。2结果2.1病毒在CEF中的增殖情况痘病毒疫苗毒接种CEF，盲传5代，出现细胞病变，细胞病变为典型的FPV形成的病毒噬斑，细胞变圆、聚堆、变性和脱落。REV感染细胞和未接种阴性对照细胞未见到明显病变。2.2PCR扩增结果出现病变的CEF提取细胞DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳，获得一条大小约为1500bp的特异性条带，与国内鸡痘疫苗毒自然重组株大小相同（见图1）。将PCR产物克隆入pMD18-TVector，所获质粒经HindⅢ，SmaⅠ双酶切获得目的片断1500bp和2.7kb两条条带，表明获得含目的基因的阳性质粒(见图2)。将阳性质粒进行测序。图1．痘病毒扩增结果1．美国痘病毒疫苗；i2.辽痘病毒疫苗；M:2000bpDNAMarkerFig.1ThePCRproductsofamplificationfromtwoFPVstrains1.USA-FPV；2.Liao-FPV；M:2000bpDNAMarker图2痘病毒扩增产物阳性质粒的HindⅢ+SmaⅠ双酶切鉴定结果1．USA疫苗株阳性质粒；2．辽疫苗株阳性质粒；M:2000bpDNAMarkerFig.2IdentificationofpositiveplasmidintegratedwithamplifiedproductofFPVbyenzymeHindⅢandSmaⅠ1.USA-FPVpositiveplasmid；2.Liao-FPVpositiveplasmid；M:2000bpDNAMarker32.3测序和分析对美国痘病毒疫苗毒株扩增产物的测序表明这一片断大小为1377个碱基（图3），将此序列递交GenBank中进行BLAST比较，可以发现该片断由三部分组成，第一部分为FPV的第201开放阅读框架编码的蛋白，位于第1-818位碱基，长818bp；第二部分为REV的LTR成分，位于第819-1012位碱基，长193bp，见图3中的斜体序列；第三部分为FPV的第203开放阅读框架编码的蛋白，位于第1013-1377位碱基，长365bp（图4）。首先我们将LTR与已经分离和鉴定的REV毒株HA9901，SNV，APC-566和713等进行序列，结果表明这一段LTR与国外REV毒株APC566、713和SNV的同源性分别为：99.6％、98.0％和87.3％，与我国REV分离株HA9901的同源性只有83.6％（图5，6）GTTAAAACGGTACTCTCTAAAGTTCATACGAGTATGAAATCGTACTACAACAATGATACGTCTCTTCCTGTCGCCGTTAAGGTGATTTACGGAACAGTAACAATATAAAAAGTGTGGAGGGAGCTCCGGGGGGAATAGCGCTGGCTCGCTAACTGCCATATTAGCTTCTGTAATCATGCTTGCTTGCCTTAGCCGCCATTGTACTTGATATATTTCGCTGATATCATTTCTCGGAATCGGCATCAAGAGCAGGCTCATAAACCATAAAAGGAAATGTTTGTTGAAGGCAAGCATCAGACCACTTGCACACTAGGTGGGGCAGCAGGGGTCCGGACTGAATCGTCGTAGTTCGGTACAACAGTATTATTGTATAATATTATATTTTGTAATATATAAAAAA图3整合片断的基因序图4REV5`LTR端的整合片断的基因相对位置图5REV整合序列与已知REV序列的进化树比较4图6REV整合序列与已知REV序列的同源性比较但是，该REV整合序列与已经测定的痘病毒毒株AJ581527(高代次分离株)、AY255633（田间分离株）、AF198100(强毒株)、AF006064(疫苗株)和AF246698(野外分离株)进行比较，发现这些毒株中均含有该REV序列，而且碱基完全一致，不仅如此，该REV序列的插入位点、序列之后的FPV序列也与上述毒株完全相同（图略）。另外，这段193bp的REV序列与另一株重组MDV毒株RM1基因组中整合的REV序列也有100％的同源性。3讨论禽痘病毒是家禽的一种常见性多发病，主要的预防措施是接种弱毒苗。然而，最近很多接种弱毒疫苗的鸡场也频频发生禽痘，给养禽业带来了巨大损失。在上世纪90年代末期，美国和澳大利亚先后发现禽痘疫苗中污染有REV[8-9]，澳大利亚学者还发现痘病毒疫苗的基因组中整合了REV前病毒的LTR序列，随后，不断有学者报道这一整合现象。如Singh等[10]报道，在美国所检测的2个FPV疫苗毒和4个野毒的基因组中均检出REV的不同大小的LTR片段，Garcia等[11]对美国的FPV疫苗株和野毒株做了进一步分析，利用分别来自FPV5和REV的不同配对的异源引物做PCR，他们从5个野毒株和4个商品疫苗株中均检测到完整或部分LTR序列，他们还显示，不同毒株整合进的REV的LTR序列不同。我国丁家波等也从国内多家疫苗生产厂家生产的痘病毒疫苗中鉴定到了REV成分，美国生产的AvianEncephalomyelitis-FowlPoxVaccineLiveVirus在我国使用普遍，为此我们对该疫苗进行了REV整合的检测，结果证实该疫苗确实存在REV序列整合，这也是对国外进口痘病毒疫苗的首次检测和报道。根据同源性分析结果，国外疫苗中的REV成分与国外痘病毒毒株中整合的REV完全一致，也表明这一疫苗株在进入中国以前就已经发生REV整合了，根据我们扩增的和测序的结果，该REV整合的LTR序列大小为193bp，整合序列与国外报道的LTR整合序列完全一致。本研究中还发现，我们检测的疫苗毒株中LTR的整合位点，与美国多株报道的痘病毒毒株之间，REV序列在痘病毒基因组上的整合位点均一致，均位于痘病毒基因组上的开放阅读框（ORF）201和203之间，具有高度的保守性，这与REV在MDV基因组整合位点的不确定性形成鲜明的对比。痘病毒基因组ORF201和203之间是否是REV整合的优势位点，还需要更多的证据证明。对FPV野毒株的研究已经清楚地表明，在过去至少50年中，带有REV遗传物质的重组FPV已成为鸡群中的主要流行群体或优势群体。国外发生禽痘病变鸡分离到的禽痘病毒中均检测到了REV前病毒成分。本实验室的陈静等应用PCR和IFA等方法也陆续检测了从国内市场上购买了国内由8个不同厂家生产的禽痘疫苗产品，并进一步检测了从田间分离到的7株痘病毒野毒株，结果也发现所有国产疫苗中均检测出REV的LTR。而7株野毒株都含有REV的gag﹑pol﹑