假单胞菌ZWL73降解4-氯硝基苯的代谢途径研究-生物谷

微生物学通报MAR20,2008,35(3):358~362Microbiology©2008byInstituteofMicrobiology,[e-mail]基金项目：国家自然科学基金项目(No.30230010)资助*通讯作者：:[e-mail]收稿日期：2007-07-09;接受日期:2007-09-18研究报告假单胞菌ZWL73降解4-氯硝基苯的代谢途径研究镇达1,2陈茂彬1*(1.湖北工业大学生物工程学院武汉430068)(2.中国科学院武汉病毒研究所武汉430071)摘要:氯代硝基芳香烃是一类环境中难以降解的有毒污染物。一株高效分解4-氯硝基苯的假单胞菌分离于4-氯硝基苯污染土壤,可以完全降解4-氯硝基苯,并以之为C源、N源生长。为阐明其降解4-氯硝基苯的代谢途径,通过对以底物生长的降解菌的酶学分析,检测到其还原降解的两个关键酶即初始酶硝基还原酶和苯环开环酶2-氨基-5-氯酚1,6-双加氧酶的活性;结合其它检测如培养液中降解产物分析、相关底物生长实验结果,确定了其降解途径是通过部分还原途径。关键词:4-氯硝基苯,生物降解,部分还原途径,硝基还原酶,2-氨基5-氯酚1,6-双加氧酶IdentificationofMetabolicPathwaysof4-ChloronitrobenzeneDegradationbyPseudomonasStrainZWL73ZHENDa1,2CHENMao-Bin1*(1.CollegeofBioengineering,HubeiUniversityofTechnology,Wuhan430068)(2.WuhanInstituteofVirology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430071)Abstract:Chloro-andnitro-substitutedaromaticsaretoxicandpersistentintheenvironment.PseudomonasputidaZWL73,isolatedfrom4-chloronitrobenzene(4CNB)pollutedsoil,cangrowon4CNBascarbonandnitrogensources.Enzymaticanalyseswerecarriedoutinordertoilluminatethedegradationpathway.Twokeyenzymaticacivitieswerefoundtobeinvovledinthedegradation:thenitroreductaseactivitythatcata-lyzingthefirststepandthering-cleavagedioxygenaseactivityleadingthesubstratetobemineralized.Thedegradationwasthereforedecidedtoprocessthroughapartialreductivepathwaytogetherwiththeproofsoftheresultsofdegradationintermediatestestandgrowthsubstratetest.Keywords:4-chloronitrobenzene,Biodegradation,Partialreductivepathway,Nitroreductase,2-amino5-chlorophenol1,6-dioxygenase氯代及硝基芳香烃是一类环境中难以降解的有毒污染物,对这类污染物的生物降解研究受到广泛关注,从20世纪80年代开始有大量关于硝基和氯代芳香烃污染物生物降解的研究,显示了微生物降解途径的多样性[1]。由于氯和硝基的同时取代使氯代硝基芳香烃芳环的不易于活化,导致比单取代芳香烃更难以降解。尽管如此,近年来国内外陆续分离到降解氯代硝基芳香烃的菌株,其中分别属于镇达等:假单胞菌ZWL73降解4-氯硝基苯的代谢途径研究359、Comamonas的3株菌的降解机理得到深入研究[26],但是有关降解机理和特性的研究仍然很少,相对于单取代芳香烃,对这类污染物的生物降解机理的了解还很不全面。这株高效降解菌株由本实验室分离于武汉一个化工厂的氯代硝基苯(4CNB)污染的土壤中。菌体呈杆状,革兰氏阴性。通过16SrRNA基因分析鉴定为Pseudomonasputida[7,8]。与前人分离到的菌株相比属于不同的属,命名为ZWL73。ZWL73菌株可以以4CNB为唯一的C、N源生长,4CNB培养的菌体能够快速转化加入的4CNB同时释放接近等量的氯离子和铵离子。通过GC-MS对培养液的分析检测到4-氯亚硝基苯的存在(未发表),这对推测4CNB的降解途径提供了一定的证据。ZWL73菌还利用邻氨基酚(2AP),2-氨基-5-氯酚(2A5CP)和硝基苯(NB)为C、N源生长,而不能利用4-氯苯胺(4-chloroaniline),苯胺(aniline)等生长[7]。为了更深入地研究PseudomonasputidaZWL73菌株利用4CNB生长的降解代谢途径及进一步克隆相关基因,我们对代谢途径的初始代谢及开环途径进行了详细的酶学分析,为以后的研究提供了有利条件。1材料与方法1.1菌株及培养方法PseudomonasputidaZWL73,4CNB完全降解菌。平板培养：ZWL73菌培养在无机盐培养基上,30℃,培养皿盖子上放置适量可挥发性底物如4CNB粉末。培养好的平板可作短期保存之用,亦可用于进一步的液体培养。液体培养前,4CNB溶于无机盐培养液(终浓度1mmol/L),经0.22µm滤膜无菌过滤后接种,在30℃、250r/min下摇动培养。无机盐培养基：每升含Na2HPO4·12H2O14.3g,KH2PO43g,MnSO4·H2O0.28mg,FeSO4·7H2O0.3mg,MgSO4·7H2O0.06mg,CaCl21mg,CuSO40.05mg,ZnSO40.05mg和H3BO30.05mg。用NaOH调pH7.0,高压蒸汽灭菌(1×105Pa)20min后备用。固体培养需要添加1.5%的琼脂粉。1.2试剂4-氯硝基苯(4-chloronitrobenzene),分析纯(上海精化科技研究所);2-氨基-5-氯酚(2-amino-5-chlorophenol),分析纯(Aldrich);还原型辅酶Ⅱ(NADPH)(Sigma)。1.3降解菌细胞提取物(粗酶)的制备[9,10]含有4CNB的100mL液体无机盐培养基接种培养ZWL73菌,从培养24h后的菌液(OD600=0.8)离心8000r/min、5min回收菌体,用等量的冰冷的20mmol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0,简称PBS)将菌体清洗2次,再用冰冷5mL缓冲液悬浮菌体,超声波破碎(Vibracell,VC750,功率270W),总时间为4min(每破碎5s,停9s),将所得的破碎液在4℃、15000r/min离心30min,取上清即为粗酶,放置冰上备用。蛋白浓度测定使用碧云天蛋白浓度测定试剂盒,采用Bradford的方法[11]。1.4硝基还原酶活性测定[12]用分光光度法检测(双光束紫外可见光分光光度计Lambda25,PerkinElmer),反应在10mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0),30℃下进行。1mL反应体系中含有0.035mg粗酶蛋白及200mol/LNADPH,在样品杯中加入0.1mmol/L4CNB时反应开始(即对照杯中仅含相同浓度的酶、NADPH、缓冲液);测定340nm处辅酶NADPH特征吸收值的减小。NADPH的摩尔消光系数E340为6220/mol·cm,一个单位(U)的酶活定义为每分钟1mol底物/辅酶消失或产物生成的酶量,比活力表示为每毫克蛋白的酶活。1.52A5CP间位开环酶活性测定[13]用分光光度法测定,1mL的20mmol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)体系中含有0.3mg酶蛋白,样品杯中加入125µmol/L2A5CP,室温下测定产物2-氨基-5-氯粘康酸半醛的395nm特征吸收峰的上升,摩尔消光系数E395:21000/mol·cm。360微生物学通报2008,Vol.35,No.3结果与分析2.1ZWL73菌的硝基还原酶活性及其与4CNB代谢的关系在含底物的无机盐培养基上生长的ZWL73菌体,经破碎后得到粗酶液。根据Park和Kim的方法[12],在室温下1mL10mmol/LpH7.0的磷酸钾缓冲液体系中,含有0.035mg蛋白和200mol/LNADPH,在样品杯中加入0.1mmol/L4CNB时反应开始,在280nm370nm范围内,每2min扫描一次如图1。其中底物4CNB在283nm的吸收峰26min后下降到接近0,而NADPH在340nm的吸收峰22min时下降到1.1左右,然后开始上升,这是因为样品杯的NADPH被不断消耗至底物消耗完毕,随着对照杯中的NADPH的自然氧化,对照杯与样品杯的NADPH浓度差距减小。根据前2min内OD340的变化计算粗酶液活性为0.37U/mg。当没有底物4CNB加入反应体系时,则没有NADPH的吸收峰的变化,可见NADPH的氧化与4CNB的转化是直接相关的。ZWL73菌的硝基还原酶活性的测出,对于确定4CNB的降解途径具有重要意义。除了根据NADPH与4CNB的转化的直接相关的证据外,我们从培养液中检测到了大量铵离子生成(见引言),说明4CNB的降解是通过还原途径。另一个证据是通过GC-MS检测到对氯亚硝基苯存在于培养液中,这相似于硝基苯的部分还原：硝基还原酶还原硝基苯的第一步反应的产物是亚硝基苯,亚硝基苯进一步还原为羟氨基苯并通过变位酶作用生成2-氨基酚[14]。图1ZWL73菌粗酶液对4CNB的硝基还原酶活性Fig.1Nitroreductaseactivitytowards4CNBincellextractofZWL73以4CNB为底物生长的ZWL73菌的粗酶液对4CNB的硝基还原酶活性的测定,283nm处是底物4CNB的吸收峰,340nm处是NADPH的吸收峰,随着4CNB被转化,NADPH被不断消耗,直到底物消耗完毕,NADPH不再减少。当对照杯的NADPH浓度由于自然氧化减少时,样品杯的NADPH的相对浓度上升,导致OD340的吸收值开始上升。ThecellextractswaspreparedfromZWL73cellsgrownon4CNB.Thespectraindicated4CNBabsorbanceat283nm,NADPHat340nm.Withthetransformationof4CNB,NADPHwasconsumeduntilthesubstratewasusedup.WhentheamountofNADPHde-creasedinthecontrolforthereasonofnaturaloxidationbyoxy-gen,therelativeamountofNADPHinthesamplecupincreased,causingOD340torise.这样可以确定ZWL73菌降解4CNB的初始代谢是经过还原途径;同时结合降解菌的代谢过程如释放铵离子的特性,可以排除芳香环加氢还原的可能(以没有硝酸根离子浓度上升为依据)。因此有必要对第一种还原方式进行仔细分析。硝基还原酶为特征的初始还原反应中,有完全还原和部分还原两种可能。在以硝基苯为代表的部分还原方式中,硝基苯的部分还原产物经过变位酶作用形成邻氨基酚的中间产物,然后通过开环进一步降解;而关于硝基在有氧条件下完全还原的例子还很少,还不能确定有这样的途径的普遍存在[1,15]。ZWL73菌