X射线晶体衍射技术

X射线晶体衍射技术姓名：陈力榕学号：2013312003年级：2013级专业：生物科学摘要：本文介绍了晶体衍射分析的原理并对X射线在晶体衍射中的应用及具体分析步骤进行了阐述。X射线晶体衍射分析能解析蛋白质晶体中原子在空间的位置与排列，迄今仍然是蛋白质和核酸三维结构测定的最主要方法，是精确测定蛋白质分子中每个原子在三维空间位置的工具。关键词：X-射线晶体衍射蛋白质结构测定X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要方法。生物大分子X射线晶体学是揭示分子结构与功能的科学。目前还没有一种工具能够用它直接观察到蛋白质内部的原子和基团的排列。虽然电子显微镜接近于看到大分子的轮廓。但是仍然仅限于揭露分子的大小、形状、对称性和聚集状态等。通过X-射线衍射法(X-raydiffractionmethod)可间接地研究蛋白质晶体的空间结构。对晶体结构的研究将帮助人们从原子的水平上了解物质。1X-射线晶体衍射技术的建立及发展1895年，伦琴(Rontgen)发现了X-ray;1913年布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了测定，指出晶体衍射图可以确定晶体内部的原子(或分子)间的距离和排列。因此获诺贝尔奖。1951年，加利福尼亚理工学院的泡令和科里提出，α-构型的多肽链呈螺旋形，通过X射线确定，组成蛋白质的都是L-型氨基酸。1953年克里克、沃森在X射线衍射资料的基础上，提出了DNA三维结构的模型。获1962年生理或医学诺贝尔奖。1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行结构分析，解决了三维空间结构,获1962年诺贝尔化学奖.1959年有机化学家豪普特曼和卡尔勒建立了测定晶体结构的纯数学理论，特别在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白质及新型药物分子结构方面起到了重要作用。因此获1985年化学奖。2X-射线测定晶体结构的基本原理Χ-射线衍射是研究药物多晶型的主要手段之一，它有单晶法和粉末χ-射线衍射法两种。可用于区别晶态与非晶态、混合物与化合物。可通过给出晶胞参数，如原子间距离、环平面距离、双面夹角等确定药物晶型与结构。粉末法研究的对象不是单晶体，而是许多取向随机的小晶体的总和。此法准确度高，分辨能力强。每一种晶体的粉末图谱，几乎同人的指纹一样，其衍射线的分布位置和强度有着特征性规律，因而成为物相鉴定的基础。它在药物多晶的定性与定量方面都起着决定性作用。当χ-射线（电磁波）射入晶体后，在晶体内产生周期性变化的电磁场，迫使晶体内原子中的电子和原子核跟着发生周期振动。原子核的这种振动比电子要弱得多，所以可忽略不记。振动的电子就成为一个新的发射电磁波波源，以球面波方式往各个方向散发出频率相同的电磁波，入射χ-射线虽按一定方向射入晶体，但和晶体内电子发生作用后，就由电子向各个方向发射射线。当波长为λ的χ-射线射到这族平面点阵时，每一个平面阵都对χ-射线产生散射，如图2-1所示先考虑任一平面点阵1对χ-射线的散射作用：χ-射线射到同一点阵平面的点阵点上，如果入射的χ-射线与点阵平面的交角为θ，而散射线在相当于平面镜反射方向上的交角也是θ，则射到相邻两个点阵点上的入射线和散射线所经过的光程相等，即PP'=QQ'=RR'。根据光的干涉原理，它互相加强，并且入射线、散射线和点阵平面的法线在同一平面上。图2-1晶体的Bragg-衍射再考虑整个平面点阵族对χ-射线的作用：相邻两个平面点阵间的间距为d，射到面1和面2上的χ-射线的光程差为CB+BD，而CB=BD=dsinθ，即相邻两个点阵平面上光程差为2dsinθ。根据衍射条件，光程差必须是波长λ的整数倍才能产生衍射，这样就得到χ-射线衍射（或Bragg衍射）基本公式：2dsinθ=nλ（5-1）θ为衍射角或Bragg角，随n不同而异，n是1，2，3……等整数。以粉末为样品，以测得的χ-射线的衍射强度(I)与最强衍射峰的强度（I0）的比值（I/I0）为纵坐标，以2θ为横坐标所表示的图谱为粉末χ-射线衍射图。通常从衍射峰位置（2θ），晶面间距（d）及衍射峰强度比（I/I0）可得到样品的晶型变化、结晶度、晶体状态及有无混晶等信息。从衍射峰位置（2θ），晶面间距（d）及衍射峰强度比（I/I0）可得到样品的晶型变化、结晶度、晶体状态及有无混晶等信息。3基本步骤3.1蛋白质单晶的制备制备蛋白质单晶常用气相扩散法和平衡透析法气相扩散法。前者是蛋白质晶中使用的标准方法，小体积比较合适,容易建立且易于监测反应进度。通常的做法是“悬滴”，即在蛋白质溶液中加入浓度不足以沉淀蛋白质的“沉淀剂”。悬滴于一个大的含有沉淀剂的储液槽相对，当把储液槽封闭后，平衡时悬滴液内的蛋白质倾向于过饱和浓度，从而引发悬滴液内的蛋白质结晶。而平衡透析法，在具有高或低离子强度的蛋白质结晶中使用。在容器中用半透膜隔开小体积的蛋白质溶液和沉淀剂，沉淀剂慢慢促使隔间中的蛋白质溶液形成晶体。结构测定的精度依赖于晶体所能达到的衍射分辨率，所以获得具有强衍射能力的晶体是蛋白质晶体结构测定分析的关键步骤，是蛋白质晶体结构分析的难点。3.2衍射数据收集和处理结构测定的目的和结衍射数据是晶体结构分析的基础，衍射数据的好坏直接关系到结果的精度。好的衍射数据于晶体的好坏、X射线源的强度以及收集数据的仪器和方法有关。蛋白质晶体暴露于空气中将解体，因为晶体中含水量相当高（20%~70%）。在收集数据前要将晶体密封于一种特殊的毛细管中。现在常使用低温冷冻晶体的方法来收集数据，蛋白质晶体快速冷冻鱼液氮中，其结构不受影响，且蛋白质分子的热运动降低，可以提供分辨率。对X射线衍射数据的收集和记录装置有两大类：一类是使用对X射线敏感的照相底片或图像板，另一类是计数管或面探测仪。他们都具有一定的自动化程度，但为了满足结构基因组学研究的要求，还有待发展衍射数据收集的全自动化装置。3.3相位确定和改进相位确定是X射线晶体结构分析的核心。最基本的方法是同晶置换法，这是用于未知结构分析的最有效方法，另外还有分子置换法、差值电子密度法，以及目前发展很快的多波长反常散射法。晶胞的大小和形状决定了晶体的衍射方向，反过来，通过衍射点的位置可以推算出晶胞参数和空间群，这叫做初步晶体学参数的测定。但晶胞中的原子种类以及它在晶胞中的分布位置决定了衍射线强度，反过来，通过衍射线强度和一些方法，可以了解相位信息，从而通过富里哀加和获得电子密度函数，获得原子在晶胞中的分布位置，这就是晶体果。由电子密度函数确定的电子密度图得质量及其后的可解释性主要决定于相角的准确性。在某些情况下采用晶胞不对称单元中等同部分的电子密度平均，有可能大大改善误差较大的起始相角。3.4电子密度图的诠释已知衍射线的结构振幅、强度和相位，通过富里哀加和就可能计算电子密度图。电子密度图时晶体结构分析的直接结果，它包含了结构的全部信息，如何从一套电子密度图分析出这些信息，尚有一系列问题需要解决。因为实验每一步都有误差，最后所有的误差都会表现在电子密度图上，在解释电子密度图之前有一些方法和原则改善电子密度图，称为电子密度图的修饰。如溶剂平滑法solventflattering、网格图修饰法histogram。3.5结构模型精化通过电子密度图分析获得的结构模型，还需要进行原子坐标的精化，结构精化主要使用的是限制性最小二乘修正。目前已经有一些全自动化的分析软件用于结构修正，如，PROLSQ、XPLOR、TNT、CNS、BUSTER、REFMAC等。最后用实体模型或模型显示系统将蛋白质空间结构显示出来。4X射线在晶体衍射分析中的应用X射线在结构分析中应用非常广泛，现已渗透到物理、化学、矿物学、冶金学、地球科学和生命科学以及各种工程技术科学之内，成为一种重要的手段和分析方法，提供系统的结构信息。4.1物相分析晶体的射线衍射图像实质上是晶体微观结构的一种精细复杂的变换，每种晶体的结构与其射线衍射图之间都有着一一对应的关系，其特征X射线衍射图谱不会因为它种物质混聚在一起而产生变化，这就是射线衍射物相分析方法的依据。制备各种标准单相物质的衍射花样并使之规范化，将待分析物质的衍射花样与之对照，从而确定物质的组成相，就成为物相定性分析的基本方法。鉴定出各个相后，可对各种组分进行定量分析。目前常用衍射仪法得到衍射图谱，用“粉末衍射标准联合会JCPDS负责编辑出版的“粉末衍射卡片PDF卡片“进行物相分析。4.2点阵常数的精确测定点阵常数是晶体物质的基本结构参数，测定点阵常数在研究固态相变、确定固溶体类型、测定固溶体溶解度曲线、测定热膨胀系数等方面都得到了应用。点阵常数的测定是通过X，通过测定衍射花样中每一条衍射线的位置均可得出一个点阵常数值。4.3应力的测定X射线测定应力以衍射花样特征的变化作为应变的量度。宏观应力均匀分布在物体中较大范围内产生的均匀应变表现为该范围内方向相同的各晶粒中同名晶面间距变化相同，导致衍射线向某方向位移，这就是X射线测量宏观应力的基础，微观应力在各晶粒间甚至一个晶粒内各部分间彼此不同，产生的不均匀应变表现为某些区域晶面间距增加、某些区域晶面间距减少，结果使衍射线向不同方向位移，使其衍射线漫散宽化，这是X射线测量微观应力的基础。超微观应力在应变区内使原子偏离平衡位置，导致衍射线强度减弱，故可以通过X射线强度的变化测定超微观应力。测定应力一般用衍射仪法。4.4晶粒尺寸和点阵畸变的测定若多晶材料的晶粒无畸变、足够大，理论上其粉末衍射花样的谱线应特别锋利，但在实际实验中这种谱线无法看到。这是因为仪器因素和物理因素等的综合影响，使纯衍射谱线增宽了。纯谱线的形状和宽度由试样的平均晶粒尺寸、尺寸分布以及晶体点阵中的主要缺陷决定，故对线形作适当分析，原则上可以得到上述影响因素的性质和尺度等方面的信息。主要方法有傅里叶法、线形方差法和积分宽度法。4.5单晶取向和多晶织构测定单晶取向的测定就是找出晶体样品中晶体学取向与样品外坐标系的位向关系。虽然可以用光学方法等物理方法确定单晶取向，但X衍射法不仅可以精确地单晶定向，同时还能得到晶体内部微观结构的信息。一般用劳埃法单晶定向其根据是底片上劳埃斑点转换的极射赤面投影与样品外坐标轴的极射赤面投影之间的位置关系。透射劳埃法只适用于厚度小且吸收系数小的样品，背射劳埃法就无需特别制备样品，样品厚度大小等也不受限制，因而多用此方法。多晶材料中晶粒取向沿一定方位偏聚的现象称为织构，常见的织构有丝织构和板织构两种类型。为反映织构的概貌和确定织构指数，有三种方法描述织构，极图、反极图和三维取向函数，这三种方法适用于不同的情况。对于丝织构，要知道其极图形式，只要求出求其丝轴指数即可，照相法和衍射仪法是可用的方法。板织构的极点分布比较复杂，需要两个指数来表示，且多用衍射仪进行测定。5X-射线晶体衍射技术的进展近年来生物大分子X射线晶体学的研究进展快速,给大量确定未知蛋白质的结构创造了良好的条件.蛋白质结晶一直是X射线晶体学中的瓶颈,但是，目前,新型的机器人结晶装置每天可以进行大于100000次的尝试,高通量的蛋白质结晶已经成为可能。而且蛋白质晶体收集和转移的条件也已大大改善,晶体放置、观测、数据收集等的自动化程度也越来越高。因此,在结构基因组学研究中,X射线晶体学承担了结构测定的大部分工作。如:SARS-Pr复合物,PCR-表达-纯化-结晶-X-ray-结构。参考文献【1.X射线晶体衍射法[J].2006,9166-171.【2.X射线晶体衍射技术的发展及应用[J].大学2001,207:30-35.【3】胡林彦.X射线衍射分析的实验方法及其应用[J].河北理工学院学2004,263:84-90.