ywt流式细胞仪的构造工作原理及数据分析

流式细胞仪的构造、工作原理及数据分析滨州医学院烟台附属医院衣文婷•流式细胞术（flowcytometery,FCM）是20世纪70年代发展起来的一种可以快速、准确、客观，可同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，并且可以对特定群体加以分选。研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。•流式细胞仪是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术为一体的新型高科技仪器。流式细胞仪的分类•分析型流式细胞仪–细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。分选型流式细胞仪–既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；–进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。BD公司分选型流式细胞仪FACSVantageSEFACSAriaIIIInfluxBeckmanCoulter流式细胞仪EpicsXL单激光四色，市场覆盖率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC500单激光或双激光五色，市场覆盖率高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分选型流式细胞仪的特点单个细胞或微粒分析同时多参数分析速度快：10000个细胞(微粒)/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞或微粒•其结构一般分为5部分：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束形成系统；光学系统；信号检测、存储、显示分析系统；细胞分选系统。（一）流动室与液流驱动系统•流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定的液体流动，鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。样本与鞘液未入管道时，边缘与中心速度一致。进入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变。流体形成层流后，会产生流体聚焦效应，所有颗粒均被推致流速最快的液流中。颗粒以衡定的速度作匀速运动。液流系统•鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。•流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。鞘液鞘液细胞流激光照射点流体动力学聚焦示意图（一）流动室和液流驱动系统流动室(flowcell,flowchamber)是流式细胞仪的核心部件。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。进样孔荧光信号激光束鞘液Sheath流动室结构图：单细胞发生器液流系统：鞘液系统＋样品流动系统-15-液流驱动系统•(二)光学系统•激光•荧光进样孔荧光信号激光束鞘液Sheath与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。反应细胞的大小和颗粒（二）流式细胞仪可检测的细胞的参数：散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射光的前向(5)散射光信号,侧向角散射光（SSC,SideScatter）入射光90角的散射光信号，散射光信号前向角散射光－FSC可反映：细胞相对大小及其表面积FALSSensorLaser散射光信号侧向角散射光－SSC可反映：细胞颗粒性程度FALSSensor90LSSensorLaser流式细胞的基本信息:“形态”外周全血细胞（红细胞溶解后）以散射光表示的双参数点图-26-（三）散射光的作用•实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片（二）流式细胞检测细胞参数:特征信息－荧光（Fluorescence）信号荧光素吸收激光（激发光波长）能量荧光素将吸收能量释放，转换为释放较入射光波长更长的光量子（发射光波长）荧光素与特异抗体结合（荧光抗体）荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生荧光信号越强荧光素与细胞核酸结合，荧光强度反映核酸含量-28-FCM可检测下列细胞成分：•表面标记物•胞浆标记物•核内标记物•可溶性成分黏附因子表面受体细胞因子分泌到胞外的细胞因子胞内抗原核酸含量核内抗原•一般检测时，获取1～2万个细胞，标记0.5～1×106细胞即可。•下述情况细胞量需相应增加：检测胞内/核内抗原，离心次数多；细胞周期乙醇固定损失细胞多；检测细胞在标本中比例低···0.5～1×106个细胞孵育体积50-100ul上机体积200-500ul终浓度约1×106个/ml加染料洗涤后补加液体细胞表面抗原标记•表面抗原分析是流式应用中最广泛的，标记步骤也相对简单。–标记：取0.5～1×106细胞，加入适量抗体(根据抗体说明书)，充分混匀后(总体积50-100ul)，4℃避光孵育10-30min。–洗涤：加入1mlPBS洗液，300g离心洗涤5min。–上机检测：弃去上清后加入200-500ulPBS，重悬细胞后立即上机检测；如不能及时上机检测，则加入同样体积的1%多聚甲醛，混匀后置于4℃冰箱内保存，一般不超过24h。荧光信号双色直接染色-33-信号检测与分析系统（三）电脉冲信号的面积A、高度H和宽度WCreationofaVoltagePulseTimeVoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0QuantificationofaVoltagePulseWidth=Area/Height淋巴细胞亚群分析流式细胞仪的科研应用树突细胞研究干细胞研究癌症病人的多药耐药性细胞动力学功能研究环境微生物分析流式细胞术与分子生物学研究谢谢