β肌动蛋白的克隆与鉴定

β肌动蛋白的克隆与鉴定王鹏邓志康石绮峰刘允刘准鑫刘斌摘要：肌动蛋白是在真核生物中普遍存在的一种古老的蛋白质之一。β肌动蛋白是肌动蛋白家族的一员，广泛表达于真核生物非肌细胞中，是构成细胞骨架的维持、细胞运动、细胞分裂等。作为一种细胞质肌动蛋白，β肌动蛋白在所有组织中相对持续稳定表达，因此β肌动蛋白基因常用作定量研究的对照基因。由管家基因的身份决定，β肌动蛋白基因的启动子为强启动子，对于提高转基因表达具有显著的效果，且其表达不受组织的限制。关键词:β肌动蛋白克隆分析一材料与方法1.1组织DNA的提取1.1.1材料细胞裂解缓冲液蛋白酶KTE缓冲液酚:氯仿:异戊烷(25:24:1)1.1.2过程1.取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于玻璃匀浆器中，加入1mL的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5mL离心管中，加入蛋白酶K20mL,混均，在65°C恒温水浴锅中水浴20min，间歇振荡离心管数次，于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一个离心管中。2.加2倍体积异丙醇，倒转混均后，可以看到丝状物，用100mL吸头挑出，晾干，用200mlTE重新溶解。3.加等量的酚：氯仿；异戊醇振荡混均离心12000rpm，5分钟4.取上层溶液至另一试管加入1/2体积的7.5mol/L乙酸铵，加入2倍体积的无水乙醇，混均后室温沉淀2分钟，离心12000rpm，10分钟。5.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上将附于管壁上的残余液滴除掉。6.用1ml70%乙醇洗涤沉淀物离心12000rpm，5分钟。7.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上将附于管壁上的残余液滴除掉。8.加200mlTE重新溶解沉淀物，然后置于4°C或20°C保存备用。1.2PCR1.2.1过程配制25毫升反应体系在PCR板中依次加入模板DNA1uL下游引物，PCR预混液12.5uLddH2O9.5uL设置PCR反应体系程序94℃532个循环94℃30s55℃30s72℃1s72℃10s上样，启动反应程序，扩增产物的产物检测1.3电泳1.3.1材料50xTAE缓冲液1xTAE缓冲液溴化乙啶贮存液6x上样缓冲液DNA样品DNALadder琼脂糖1.3.2过程制备1%琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖置于锥形瓶中，假如150mlTAE，瓶口倒扣小烧杯100℃加热煮沸3次，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶。胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃与内槽两端边缘封好，形成模子将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶混匀小心倒入内槽，形成均匀胶层。加样：在点样板伤感混合DNA样品和上样缓冲液。电泳：加样后的凝胶立即通电进行电泳，加压110V，样品由负极向正极方向移动。观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显绿色荧光带，拍照保存。1.4连接1.4.1过程与T载体连接（PUD-18T）PUD-18T取0.5-1.0μ，回收纯化的DNA2μ（或3-4μ）看具体浓度加水互补至5μl再加入5μlsolutionⅠ（冰上助融）共10μl在16℃放置30min之后4℃过液转化：大肠杆菌（DH5α）1.从-70℃冰箱中去除感受态细胞，放入冰水中融化，放置大约10min2.用冷却后无菌吸头将连接好的DNA混合液加入到感受态细胞中（没100μl感受态细胞加连接产物5μl）轻旋转，混匀内容物，在冰上放置30min3.再将离心管放到42℃的水浴锅中热激90s切勿摇动试管4.迅速转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min5.每管加400μl的LB液体培养基，转移到37℃摇床上，温浴45min转速不超过125转，使细胞复苏（一般得4-5H菌液才能浑浊）摇完后4000rpm离心2-3min，弃去上清200μl，使菌液浓度增加，用枪吹打后，再涂平板（此步可在4℃保存）6.涂平板，尽量迅速至菌液被吸收，如吸收不完全正放30min之后倒放在37℃培养箱过液1.5转化1.5.1过程从-70℃冰箱中取出感受态细胞，放入冰水中融化，大概放置10min;用冷却的无菌吸头将连接好的DNA混合液加入到感受态细胞中（没100μL感受态细胞加连接产物5μL）轻轻旋转，混匀内容物，在冰上放置30min；再将离心管放到42℃的水浴锅中热激90s,切勿摇动离心管；迅速转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min;每管加400μL的LB液体培养基，转移到37℃摇床上125转，使细胞复苏，摇完后4000rpm离心3min，弃去上清液200μL，然后用枪吹打后涂平板，37℃培养箱中过夜；用枪头挑单菌落接于5mL液体LB培养基中，摇12h后提取质粒。用EcoRⅠ和HindⅢ进行质粒双酶切或PCR鉴定1.6质粒DNA的提取1.6.1材料1.X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-D半乳糖)X-gal溶于N，N＇-二甲基甲酰胺中配20mg/ml原液。-20℃避光保存2.IPTG（异丙基-β-D半乳糖苷）0.2g/ml分装贮存于-20℃3.氨苄青霉素（Ampiaillin）1gAmpiaillin溶于5ml灭菌水中。配成母液保存于-20℃1.6.2方法平板准备：在40微升X-gal（中加入4微升IPTG充分混合，在无菌条件下涂布于含AMP（浓度50微升每毫升）的LB平板上将平板至于37℃恒温箱中2-3h，意识培养基充分吸收色素底物X-gal涂板：将转化菌在无菌条件下涂布于含抗生素和X-galIPTG的平板上正面朝上放置30分钟，待菌液完全被吸收后倒置平板。37℃培养12-18h1.7验证PCR扩增实验实验材料：1.仪器：吸头，PCR仪器，移液枪2.材料PCR预混液12.5微升，水9.5微升，上游引物1微升，下游引物1微升，组织DNA1微升实验内容及步骤：1配制25微升反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液中模板RNA1微升上游1微升下游引物1微升，PCR预混液12.5微升，ddH2O0.95微升。2.设置PCR反应程序强变性94摄氏度5分钟变性94摄氏度30秒退火58摄氏度30秒延伸72摄氏度1分钟最后延伸72摄氏度8分钟共32个循环3.上样启动反应程序4.扩增产物的电泳检测（取5毫升）项目：电泳实验所用设备：水电泳槽，电泳仪，凝胶成像分析系统，微波炉，微量移液器，透明胶带，点样板，锥形瓶，量筒，吸头。50XTAE,Tris溶液，EDTA溶液，去离子水，1XTAE缓冲液琼脂糖溴化乙叮贮存液，溴化乙啶，溴酚蓝，甘油，其他,DNA样品。实验内容及步骤：1.琼脂糖凝胶电泳的制备：称取1.5克琼脂糖置于锥形瓶中，加入150毫升1XTAE瓶口倒扣小烧杯100摄氏度加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成百分之1琼脂糖凝胶液。2.胶板制备：取电泳槽内有机玻璃内槽洗干净晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与槽两端边缘封好形成模子。将内槽置于水平位置，并固定位置放好梳子，将冷却到65摄氏度左右的琼脂糖凝胶完全凝固垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶剂内槽放入电泳槽中，添加1XTAE电泳缓冲液至没过胶板为止。3.加样：在点样版上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1x，用1微升微量移液管枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品应更换一个加样头，以防止污染，加样时五碰坏样品周围的凝胶面。4.电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60—100伏特，样品由负极向正极方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离，范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1CM处时，停止电泳。5.观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带采用凝胶成像系统拍照保存。二结果分析实验成功提取出目的基因，进行PCR扩增，然后进行电泳，电泳表现出荧光带并且两条荧光带都处在100~200bp之间，证明PCR扩增成功。再进行蓝白斑验证时，由于没有立即涂匀氨苄青霉素导致培养基中心青霉素浓度过高，没有生长菌落。从没有加入X-gal和IPTG的培养基中挑去菌落放入液体培养基进行培养，共6只试管并且全部长菌。进行电泳验证，电泳表现出两条荧光带，证明试验成功。我组组员严格要求实验步骤进行试验，从而实验成功。参考文献[1].{生命的化学}2002年22卷3期[2].刘秀霞肌动蛋白基因cD-NA全序列与5侧翼区的克隆与分析[3].林万明著，PCR技术操作与应用指南，北京人民军医出版社，1993年