分子生物学 研究方法(上)

第五章分子生物学研究方法（上）本章主要内容常见的DNA操作技术基因克隆技术简介蛋白质组学及研究技术引言重组DNA技术发展史上的重大事件(1)40年代，解决了遗传的物质基础问题。确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质。(2)50年代，解决了基因的自我复制和世代交替问题。建立了DNA分子的双螺旋结构模型，提出了半保留复制机制。(3)50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达途径。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA。基因工程的主要内容或步骤“分---切---连---转---筛”（1）从基因组中分离、或PCR扩增、或人工合成带有目的基因的DNA片段。（2）用适当的限制酶分别切割适当的载体分子和含有目的基因的DNA分子。（3）将目的基因连接到载体分子上，形成重组DNA分子。（4）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞中并增殖。（5）筛选重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。1962年Arber发现限制性核酸内切酶，1967年Gellert发现了DNA连接酶。重组DNA实验中常见的主要工具酶酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5ˊ到3ˊ方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5ˊ-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。1DNA操作技术•DNA分子的切割与连接•核酸分子杂交•凝胶电泳•细胞转化•核酸序列分析•基因的人工合成•基因的定点突变•PCR扩增•基因敲除1.1核酸的凝胶电泳原理：种类：琼脂糖（agarose）凝胶电泳；聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳用途：鉴定重组DNA分子蛋白质与核酸相互作用DNA分型DNA核苷酸序列分析限制酶酶切片段分析限制酶酶切作图琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1-1000个碱基对凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。1.2转基因方法1.2.1细菌转基因的方法(1)结合（conjugation）(2)转化（transformation）(常规转化、电转化等)(3)转染（transfection）(4)转导（transduction）1.2.2动物转基因的方法(1)显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。(2)电导转基因法(3)逆转录病毒介导法(4)胚胎干细胞介导法(5)精子载体法1.2.3植物转基因的方法(1)Ti质粒介导(2)电转化法(3)基因枪法1.3.1放射性同位素技术同位素：原子序数相同而质量不同的元素。放射性同位素同位素可分为稳定同位素和不稳定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生α-射线、β-射线和γ-射线等，同时从不稳定同位素变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用的是放射性同位素。1.3核酸的分子杂交放射性的衰变类型α-射线：带正电荷的高速粒子流β-射线：带负电荷的粒子流γ-射线：光子流分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质元素名称半衰期12.1年5700年14.3天87.1天5.8年147N+10n→146C+11H146C→147N+0-1e23892U→20682Pb+842He+60-1e(t1/2=4.5×109a)放射性强度的探测（1）盖革计数器（Geigercountertuber），闪烁计数器。（2）放射自显影：X-光乳胶片覆盖于样品，在黑暗中，-70℃，曝光。放射性分子的制备：核物理，化学，生化反应，生化分离技术核酸分子的放射性同位素标记应用举例利用切口平移技术制备DNA放射性探针1.3.2分子杂交类型根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3种类型：Southern杂交由E.M.Southern于1975年创立。Southern杂交：将DNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，然后与核酸探针进行杂交。Northern杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，然后与核酸探针进行杂交。Western杂交：将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质进行反应。1.3.3核酸分子杂交复性（退火）：在一定条件下变性的两条单链重新结合为双链的过程杂交：来源不同的两条单链结合为双链分子的过程。核酸探针：指序列或功能特性已知的标记分子，为双链或单链，长度通常为几十至几百bp,包括DNA探针、RNA探针和cDNA探针。若退火的核酸来自不同的生物有机体，则所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。（1）Southern杂交（Southern印迹）：用适当的限制酶消化待测DNA，电泳后，将凝胶浸于碱性溶液中以变性DNA，再经毛细作用将变性的DNA从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自显影显示杂交结果。该技术可有效地分析基因结构或检测待测DNA样本中是否含有特定的序列。1)电泳:将已酶切的待检DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。2)转膜:将分离的核酸样品转移到滤膜上（印迹转移）。3)杂交:将滤膜与标记的DNA或RNA探针进行杂交。印迹法：凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法。杂交膜：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。放射自显影DNA印迹转移探针杂交－＋杂交模式图某作者用人的一放射性DNA探针与鼠基因组DNA进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第1泳道的点样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点；第2泳道呈较长的弥散形杂交带；第3泳道有3条较清晰的杂交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。试分析上述实验结果。例题：Southern杂交应用举例环状芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定环状芽孢杆菌C-2基因启动子探针与重组DNA分子的斑点杂交（2）斑点杂交（Dotblot）：直接将DNA样品点在滤膜上使之成为斑点，变性并固定，与探针杂交，放射自显影。检测重组体克隆的菌落杂交技术（3）菌落原位杂交（Hybridizationinsitu)：又分为菌落杂交和空斑杂交。在杂交膜上接种转化子细胞，裂解以释放待检DNA，变性并固定DNA，与探针杂交，放射自显影。用于鉴定阳性重组体。（4）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）：指组织或细胞的原位杂交。经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，以确定探针互补序列在胞内的空间位置。LocalizationofRNA1.4聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR）PCR技术简史1.4.1PCR原理PCR是一种体外无性扩增DNA的实验技术。待扩增DNA片段经高温变性成为单链后，在低温（如52℃）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下以每一条单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分别合成一条新链。经过解链、退火和链延伸等多个循环反应，原DNA片段就可得到大量扩增。注:Taq来自ThermusaquaticusPCR仪1.4.2PCR反应体系TmplateDNADNAPrimersdNTPsTaqDNAPolymerase10×Buffer1.4.3基本反应步骤1个循环包括高温变性、低温退火和中温延伸反应。经n次循环后,一个DNA分子可扩增为2n个分子。①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便与引物结合。②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链上的互补序列配对结合。③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNA互补的链。一般每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。1个PCR循环产生2条双链分子PCR的基本原理模板DNAPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点引物1引物2PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点引物1引物2Taq酶Taq酶PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点第1轮结束PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点第2轮结束•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增电泳分析PCR设备电泳分析（3）PCR的应用•反向PCR：扩增已知序列旁侧的未知DNA序列•锚定PCR:用于测定基因结构•不对称PCR:用于扩增某一单链模板•RT-PCR(逆转录-PCR):逆转录联合PCR以扩增cDNA•复合PCR:用多对引物同时扩增几条DNA片段•易错PCR：引入错配碱基，导致随机突变•荧光定量PCR:用于估计模板DNA的浓度•免疫PCR：扩增抗原-抗体复合物上的DNA分子•原位PCR：在组织或细胞标本片上直接进行PCR•微生物PCR:用于微生物的鉴定和分类设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常为20nt左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。避免5个以上相同碱基的成串排列。④引物内部应避免出现出现二级结构，避免两条引物间互补。⑤引物3ˊ末端碱基，应与模板单链严格配对。⑥引物中具有或能够加上合适的酶切位点。⑦特异性：与数据库中的其它序列无明显同源性。pPICZα物理图谱定向克隆应用举例PrimerF：5ˊ-GCTGAATTCATGGGCAACTCAGCGCTCGACCTT-3ˊPrimerR：5ˊ-TGTTCTAGATTAGACGTTACCGGCGGCGCCAGT-3ˊ上、下游引物的5ˊ端分别设有1个EcoRⅠ和1个XbaⅠ酶切位点（黑体字母表示）及3个保护碱基。定向克隆应用举例---PCR引物设计粗毛栓菌热激蛋白cDNAPCR扩增---引物设计:5′CTTCCACGACGCTATC----//---GAGAGATTCGCCTGCA3′关于PCR引物设计例题1：根据以下cDNA编码区片段的两末端已知序列，如何设计下游引物，以扩增该cDNA片段。例题2:如何利用网络技术和DNA分析软件设计简并引物,以PCR扩增某蛋白的cDNA?演示:(1)登录NCBI等网站,收集有关cDNA序列信息;(