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管碟法测定抗生素效价[作者：佚名文章来源：不详点击数：108更新时间：2007-5-31][收藏本文]热一、目的和要求1、了解管碟法的原理。2、掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。二、原理抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。三、实验材料1、四环素类抗生素的标准品和样品。2、试验菌：藤黄八叠球菌（Sarcinalutea）。3、培养基：250ml三角瓶分装150mlLB琼脂，150ml三角瓶分装50mlLB琼脂，50ml三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。4、灭菌物品：培养皿，牛津杯（内径：6.0±0.1mm，外径：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。5、其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。四、实验实施1、配制标准品溶液2、配制样品溶液3、制备菌悬液。4、制备平板：（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。（2）另取冷却至50℃左右的50mlLB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。5、在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。6、用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。7、将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养16～18h。实验四十四抗生素效价的生物测定2007-11-04点击:8本文共1篇文章实验四十四抗生素效价的生物测定一、目的要求学习了解抗生素效价的生物测定（管碟法）的基本原理和方法。二、基本原理某些微生物在代谢过程中所产生的次级代谢产物能在低浓度的情况下抑制或杀死某些微生物，这种物质称为抗生素。抗生素效价的生物测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。管碟法是扩散法中的一种，本法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液与未知浓度的样品溶液在含有敏感性试验菌的琼脂表面进行扩散渗透，比较两者对被试菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以测定抗生素的浓度。在一定范围内，浓度与抑菌圈直径在双周半对数表上（浓度为对数值，抑菌圈直径为数字值）成直线函数的关系，由此绘制成标准曲线，从样品的抑菌圈大小可在标准曲线上求得其效价。由于本法是利用抗生素抑制敏感细菌的特点，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度也很高，不需特殊设备，故一般实验室及生产上多采用此法。但此法也有缺点，即操作步骤多，手续繁杂，培养时间长、得出结果慢。尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规的范围内。本实验以龟裂链霉菌（Streptomycesrimosus）产生的土霉素效价测定为例。三、器材黄色八叠球菌（Sarcinaflava）；（土霉素效价测定用）培养基，（供培养试验菌用）培养基Ⅰ，（供摊布双碟的上、下层用）培养基Ⅱ；培养皿，牛津杯（或不锈小钢管），陶瓦圆盖，50ml、250ml、1000ml容量瓶，0．1mol/LHCl，土霉素标准品等。四、操作步骤1．pH6．0磷酸缓冲液的配制准确称取KH2PO40．8g和K2HPO40．2g，置100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，灭菌备用。2．标准土霉素溶液的配制精确称取20mg土霉素标准品，每毫克含880单位（880r/mg），先用0．1mol/LHCl溶解（按称量每10mg加酸1ml），然后加入无菌蒸馏水稀释成每毫升含1000单位（1000r/ml）的溶液，此液在5℃以下保存。3．被测样品溶液的制备精确称取样品20mg左右，先用0．1mol/LHCl2ml溶解，然后再用无菌蒸馏水稀释成估计每毫升含1000单位，再吸取1ml至50ml容量瓶中加pH6．0磷酸缓冲液至刻度，稀释成估计每毫升含20单位的样品溶液。4．黄色八叠球菌菌液的制备取每周接种一次、用普通琼脂斜面保存的黄色八叠球菌菌种，在试验前一日，将细菌接种于盛有培养基Ⅱ的试管斜面上，于28℃培养24小时后，用培养基Ⅰ约5ml将菌洗下，即得。5．双碟的制备取直径90mm，高15mm的双碟27个，分别注入已溶解的培养基Ⅱ20ml，摇匀，置水平位置使凝固，作为底层。另取培养基Ⅱ，溶解后冷至48—50℃，加入上述黄色八叠球菌菌液适量（以能得清晰的抑菌圈，使每1ml含土霉素20单位的标准液所致的抑菌圈直径在15—18mm为合适），迅速摇匀，在每个双碟中分别加入5ml此含菌培养基，使在底层上均匀摊布，作为菌层，置水平位置待凝固后，在每双碟中以等距离均匀放置牛津杯6个，用陶瓦圆盖覆盖备用。6．标准曲线的制备取50ml容量瓶9只编号，并向各瓶内分别加入不同量的每毫升含1000单位的标准品溶液，用磷酸缓冲液释稀至刻度，使成每毫升含土霉素8、10、12、16、20、24、28、32、36单位9种浓度的标准品稀释液（表Ⅹ-3）。取上述制备的双碟24个，每碟的6个牛津杯间隔的3杯中各装每毫升含20单位的标准品稀释液，将每3个双碟组成一组，共分8组。在第一组的3个双碟的空杯中各装入每毫升含8单位的标准品稀释液；第二组的空杯中各装入每毫升含10单位的标准品稀释液，依次将8种浓度的标准品稀释液装毕。如图X-6。共得每毫升含20单位的标准品稀释液72杯，其他各种稀释度的标准品各得9杯，全部双碟盖上陶瓦圆盖后置37℃培养16—18小时。测量各抑菌圈的直径，分别求得每组3个双碟中的每毫升中含20单位标准品抑菌圈直径与其他各种浓度标准品抑菌圈直径的平均值，再求出8组中每毫升含20单位标准品的抑菌圈直径总平均值，总平均值与各组中每毫升含20单位的抑菌圈直径平均值的差数，即为各组的校正数，根据各组校正数将8种浓度的抑菌圈平均值校正。例如：如果8组每毫升含20单位的标准品的抑菌圈直径总平均值为17．0mm，而每毫升含12单位的一组中9个每毫升含20单位标准品的抑菌圈直径平均为16．8mm，则其校正数应为17．0-16．8=0．2，如果9个每毫升含12单位标准品的抑菌圈直径平均为16．4mm，则校正后应为16．40．2=16．6（mm）。以浓度为纵坐标，校正后的抑菌圈直径为横坐标，在双周半对数图纸上绘制标准曲线。7．测定法取上述已制备好的双碟3个，在每碟6个牛津杯间隔的3杯中各装入每毫升含20单位的标准品稀释液，其他3杯中各装入估计每毫升含20单位的样品溶液，盖上陶瓦圆盖，置37℃培养16—18小时，测量各抑菌圈的直径，分别求得标准品稀释液和样品溶液所致的9个抑菌圈直径的平均值，照上述标准曲线的制备方法求得校正数后，将样品溶液所致的抑菌圈直径的平均值校正，再从标准曲线中查得样品溶液的效价，并换算成被测样品每毫克所含的单位数。五、实验报告1．结果被测样品的效价是每毫升含多少单位？2．思考题（1）什么叫抗生素？它对微生物的作用机制有几种？举例说明之。（2）抗生素效价测定中，为什么常用管碟法测定？XIV水的细菌学检查2007-11-17点击:2本文共1篇文章XIV水的细菌学检查生活用水的水源常被生活污水或工业废水或人与动物的粪便所污染。粪便污物含有不同类型的微生物，有腐生性的和病原性的。腐生性微生物对人无害，而病原性微生物则能引起传染病的发生。水源水如湖水、池水和溪水，常含有很多腐生菌，但仍可安全地饮用。然而水源一旦被粪便污染，就可能也被肠道病原体污染而引起肠道传染病甚至流行病，如霍乱、伤寒、细菌性痢疾和阿米巴性痢疾以及脊髓灰质炎和传染性肝炎等病毒性疾病。测定水样是否合乎饮用标准，通常包括下列两个项目：一、细菌总数测定水中细菌总数可说明被有机物污染的程度。细菌数越多，有机物质含量越大。细菌总数是指1ml水样在普通琼脂培养基中，37℃经24小时培养后，所生长的菌落数。我国规定自来水1ml的总菌数不得超过100个。二、大肠菌群的测定如前所述，若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异，因此数量较少，要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时，这样就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。若指示菌在水中不存在或数量很少，则大多数情况也保证没有病原菌。最广泛应用的指示菌是大肠菌群（coliformgroup），它的定义是：一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，并在乳糖培养基中，经37℃24—48小时培养能产酸产气。根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。我国规定每升自来水中大肠菌群不超过3个；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得超过10000个。检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。多管发酵法使用历史较久，又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性好，又能测定大体积的水样，目前国内因尚无大量滤膜供应，故只有北京、天津、上海等水厂采用。实验五十四抗原与免疫血清的制备2007-11-11点击:3本文共1篇文章实验五十四抗原与免疫血清的制备一、目的要求1．学习抗原与抗体的一种制备方法。2．为“凝集反应”实验准备材料。二、基本原理将抗原注射于动物体，使其产生相应的抗体，待动物血清中产生大量的抗体时，采出动物的血液，分离析出血清，此即含抗体的抗血清或称免疫血清。制备特异性强、效价高的免疫血清对于微生物的鉴定，疾病的诊断与治疗以及抗原的分析均有很大的用途。动物产生抗体的量，一方面可因动物的种类、年龄、营养状况及刺激部位的感受性的不同而不同外，另方面还与抗原的种类、注射量、注射途径、注射次数以及注射的间隔时间有关。抗原量低到一定限度时，抗体不能产生或用现有方法不能测出，但超过最高限度对抗体的产生反起抑制作用。在最低限度以上，抗体根据抗原量的增加而增加，达到最高限度时，即不再增加。每种类型的抗原，其使用量都是根据经验而得出的。本实验的抗原是细菌细胞，采用每毫升中含9亿个细菌，比较恰当。抗原初次注射后，经一段诱导期，血清内即可找到抗体，以后逐渐上升，抗体量一般不高，然后逐渐下降。但再次注射时，抗体量迅速上升到最高水平，而且维持时间也长。因此，制备抗体一般需要多次注射抗原，才能得到高效价的免疫血清。注射途径最常用的是静脉。三、器材24小时培养的大肠杆菌斜面，2kg左右的健康雄家兔或未孕的健康雌家兔；硫柳汞，0．5%石炭酸生理盐水，McFarland比浊管，酒精棉花，碘酒棉花，消毒干棉花，灭菌吸管，毛细滴管，小试管，大试管与离心管，2ml和20ml注射器与老编号18号与24号针头，灭菌细口瓶，离心机等。四、操作步骤1．抗原的制备(1)吸取灭菌的0．5%石炭酸生理盐水5ml，注入大肠杆菌斜面培养物上，将菌苔洗下。(2)用无菌毛细滴管吸取洗下的菌液，注入无菌小试管。(3)将此含有菌液的小试管放60℃的水浴箱中1小时，并不时摇动。(4)取一与比浊管同质量的小试管，加菌液1ml，再加石炭酸生理盐水4ml（或更多，视原菌液浓度而定），混匀后与各比浊管比浊。假若与第3管的浊度相等，则此菌液每毫升的细菌数为：5×900000000＝4500000000（45亿）附McFarland比浊管配制法用同质量同大小的试管10支按下表加入药品。(5)稀释用0．5%石炭酸生理盐水将菌液稀释至每毫升含9亿个细菌。(6)无菌