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分子杂交基本原理杂交基础：DNA分子由两条反向互补结合一定条件可解链的单链构成DNA变性指双连DNA解旋、解链，形成无规则线团，发生性质改变的过程。（获得DNA单链的过程）条件：高温；化学试剂。Tm（解链温度、变性温度、熔解温度、熔点）：使DNA解链达50%的温度。影响：碱基组成：Tm=(𝐺−𝐶)%×0.41+69.3溶液pH离子强度：正相关表现：增色效应：DNA紫外吸收增加。DNA复性（退火）指缓慢降温，恢复其生理条件，变性单链DNA自发互补结合，重新形成双连结构的过程。条件：Tor（最适复性温度）：Tor=Tm−20~25影响：复性速度加快：变性不彻底；序列简单；小片段；高浓度；高离子强度。表现：减色效应：DNA紫外吸收降低。核酸杂交指序列存在一定程度互补性的变性DNA混合退火可以形成双连结构的现象。杂交体（杂交双螺旋、杂交分子）：不同来源的DNA形成的双链结构。条件：序列互补性。分类：液相杂交固相杂交基本过程：将参加反应的核酸固定在固相支持物上；与杂交液游离探针进行杂交。探针指已知序列的标记核酸片段。待测核酸：未知序列核酸。（理想）基本条件：标记物；单链核酸；高度特异性（基因编码序列）；灵敏度高而稳定，方法简便安全。种类基因组DNA探针cDNA探针寡核苷酸探针：15~30ntRNA探针标记物分类：放射性标记物优点：灵敏度高；相同化学性质；高特异性。缺点：短半衰期受限；污染环境。常用：32P、3H、35S。[32P]–NTP或[32P]-dNTP非放射性标记物生物素—碱基（核苷酸）不影响：核苷酸反应活性、特异性、碱基配对能力。—抗生物素蛋白（鸡蛋清，pI=10.5）—链霉抗生物素蛋白（阿维丁链霉菌，pI=7.25~7.45）—荧光素→荧光分析—酶→呈色反应地高辛（类固醇半抗原化合物，洋地黄）—抗地高辛抗体—荧光素|酶荧光素异硫氰酸荧光素（FITC）|罗丹明—紫外线标记法体内标记放射性底物→细胞培养液→核酸分子（细胞）体外标记化学法：标记物活性基团+探针基团酶法：标记物+核苷酸—酶促反映→探针（合成|交换）切口平移标记法基本过程：适当浓度DNaseⅠ随机切割DNA双链；大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（5’→3’外切酶活性）依次切口5’端核苷酸；大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（5’→3’聚合酶活性）标记核苷酸连接到3’；PCR标记法基本过程：以4种dNTP为底物（其中一种标记）。随机引物标记法基本过程：探针变性；与随机引物退火；加Klenow片段，4种dNTP，合成互补连。末端标记法酶T4多核苷酸激酶（T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞）：γ磷酸基（ATP）→5’-羟基（碱性磷酸酶→脱磷酸基）末端转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶）（小牛胸腺|髓细胞）：脱氧核苷酸→3’-DNA（单链或粘端）T4DNA聚合酶（T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞）Klenow片段补齐纯化乙醇沉淀法：无水乙醇→沉淀DNA片段。凝胶沉淀法：凝胶分子筛；填料：SephadexG-50|Bio-GelP-60.印迹法固相支持物硝酸纤维素膜尼龙膜普通尼龙膜正电荷修饰尼龙膜活化滤纸印迹方法印迹：指将凝胶中的待测核酸转移到固相膜上，转移后各待测核酸片段在固相膜上的相对位置和在凝胶中的位置一样。毛细管虹吸转移法真空转移法电转移法基本过程样品电泳分离印迹：转移到固相膜预杂交：关闭核酸结合位点杂交分析影响因素严格杂交：指要求杂交序列完全互补。错配杂交：要求形成含Watson-Crick碱基对的杂交体。温度Tor离子强度和甲酰胺浓度时间促进剂惰性多聚体硫酸葡聚糖聚乙二醇探针核算分子非特异性杂交封闭物：变性的非特异性DNA；高分子化合物。核酸分子杂交印迹杂交DNA印迹法基本过程：提取DNA；琼脂糖凝胶电泳，大小分离；碱处理电泳凝胶，DNA原为变性；转移到固相膜；封闭物预杂交，漂洗；探针杂交浸泡；漂洗；显影或显色。RNA印迹法基本过程：变性；琼脂糖凝胶电泳；转移；杂交。原位杂交斑点杂交法|狭缝杂交法菌落杂交法|噬菌斑杂交法基本过程：硝酸纤维素膜拓印菌落；碱处理，释放DNA；预杂交；杂交；分析。原位杂交（组织原位杂交）基本过程：切片增透；探针杂交。等位基因特异性寡核苷酸杂交法ASOH蛋白质分子杂交基本过程：电泳分离（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）；印迹；封闭；检测分析（抗原-抗体反应）。蛋白质—一抗—二抗（酶标抗体）—过氧化物酶|碱性磷酸酶—呈色反应核酸的体外扩增：指通过无细胞体系的化学反应实现目的DNA的扩增。PCR技术（聚合酶链反应）基本原理基本过程体内DNA半保留复制变性：高温。退火：DNA分子复性，重新形成双螺旋结构。延伸：升温延伸。30次循环。产物：长链DNA：2n短链DNA：2𝑛−2n体系组成引物（2）：与目的DNA两股链3’端互补。酶：TaqDNA聚合酶|TthDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶（水生栖热菌YT1株）：75~80℃；底物dNTP；5’→3’外切酶；3’→5’聚合酶；逆转录酶（Mg2+|Mn2+）；类似末端转移酶（3’—核苷酸【dAMP】）dNTP：一定浓度：四种相等；小量分装。模板Mg2+：缓冲液反应条件温度：90~95℃→45~60℃→70~75℃（较短DNA：二温度点法，65℃）时间：15~30s→30~60s→1min最适退火温度=4(𝐺+C)+2(𝐴+T)−(5−10)次数：25~30次产物分析凝胶电泳分析酶切分析分子杂交分析测序分析特点特异性强灵敏度高简便快捷样品要求低发展逆转录PCR定量PCR多重PCR重组PCR不对称PCR原位PCR反向PCR共享引物PCR随机引物PCR等位基因特异PCR克隆PCRPCR-RFLPPCR-ASOHPCR-SSCP重组DNA技术指制备DNA克隆所采用的技术和相关工作的统称。克隆：指通过无性繁殖产生的与亲代完全相同的子代群体。DNA克隆：特定DNA与DNA载体连接成重组DNA，再导入合适细胞分裂扩增，大量拷贝。基本过程：目的DNA：限制酶；载体；重组DNA：连接酶；宿主细胞；筛选鉴定。基本原理工具酶限制酶分类：Ⅰ型限制酶：限制点1kb，不定。ATP|Mg2+|SAMⅡ型限制酶：限制点附近，不定。Mg2+Ⅲ型限制酶：限制点内部，确定。ATP|Mg2+|SAM命名：细菌学名大写，属名；小写，种名，种名；菌株；罗马数字，限制酶编号识别和切割：限制位点：4~8bp；回文结构。限制性片段末端黏端：5’黏端|3’黏端平端影响：底物纯度；甲基化程度：Dam甲基化酶|Dcm甲基化酶；结构；反应温度；体系：MgCl2|Tris-HCl|巯基乙醇或二巯基苏糖醇|NaCl或KCl|牛血清蛋白。DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶T4DNA连接酶DNA聚合酶DNA聚合酶ⅠKlenow片段TaqDNA聚合酶逆转录酶T4DNA聚合酶修饰酶碱性磷酸酶末端转移酶T4多核苷酸激酶甲基化酶核酸酶核酸酶S1核酸酶Bal31外切核酸酶Ⅲ脱氧核糖核酸酶Ⅰ核糖核酸酶A多聚核苷酸激酶λ噬菌体外切酶外切酶Ⅲ载体指目的DNA片段连接到的一种特定的、能自我复制的DNA分子。克隆载体：用来克隆和扩增目的DNA的载体。组成：复制起点ori，克隆位点，选择标记。表达载体质粒载体命名：p；发现者，大写；实验室，大写；编号复制类型：拷贝数：一种质粒在一个细胞内存在的数目。严密型：同步复制，1~3松弛型：不同步，10~200常用：pBR322基本结构：ori（1）；抗性基因：氨苄青霉素抗性基因ampR，四环素抗性基因tetR；多种单一限制位点。pUC系列基本结构：ori；ampR，lacZ’（启动子lacP、操纵基因LacO、结构基因lacZ’）；多克隆位点（lacZ’内）；lacI（调节lacZ’）噬菌体载体λ噬菌体载体：生命周期：溶菌性生长；溶原性生长。基因组：cos黏端CCCGCCGCTGGA类型：插入型替换型M13噬菌体载体酵母人工染色体过程目的DNA分离纯化逆转录合成PCR扩增化学合成载体重组平端连接互补黏端连接加同聚物尾连接加人工接头连接导入转化：外源DNA导入宿主细胞，获得新的遗传表型。转导|感染：通过噬菌体或病毒。转染：转化培养的真核细胞。导入原核细胞：CaCl2法电穿孔法病毒感染法导入真核细胞：瞬时转染独立于染色体之外稳定转染整合筛选鉴定平板筛选（新的表型）普通抗菌素平板插入失活抗菌素平板蓝白筛选（lacZα互补IPTGX-gal蓝色）核酸分子杂交分析PCR分析酶切分析免疫分析表达表达载体：指含有能被宿主表达系统识别的表达元件、从而可以利用宿主表达系统表达目的基因、合成目的蛋白的载体。表达元件原核：启动子、核糖体结合位点、转录终止位点。真核：增强子、启动子、核糖体结合位点、转录终止信号、加尾信号。偏爱密码子调节开关大肠杆菌表达系统包涵体指目的基因在大肠杆菌中表达时形成的一种高密度、不溶性蛋白质颗粒。酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统应用构建基因文库基因定点诱变基因工程药物原癌基因和抑癌基因肿瘤细胞：自主分裂不受体内生长调控系统控制。原癌基因发现Rous肉瘤病毒（RSV）——最早研究src基因——最早发现癌基因（onc）rasRas信号转导蛋白+GDP无活性+GTP活性原癌基因：癌基因的编码产物可以转化培养细胞或在动物体内诱发肿瘤，能激活癌基因的正常细胞基因。定义原癌基因：存在于细胞基因组中的一种正常基因，其功能是控制细胞生长和分化。癌基因：原癌基因突变，其编码产物可以转化培养细胞或在动物体内诱发肿瘤。病毒癌基因：存在于致癌病毒基因组内的癌基因。命名myc、ras、src分类根据表达产物在细胞内定位根据基因结构和功能特点src癌基因家族ras癌基因家族：H-ras，K-ras，N-rasmyc癌基因家族sis癌基因家族erb癌基因家族myb癌基因家族bcl-2癌基因家族：最重要的控制细胞凋亡的基因家族。根据编码产物的生理功能：生长因子基因、生长因子受体基因、信号转导蛋白基因、转录因子基因、细胞凋亡相关基因、细胞周期蛋白基因。性质激活点突变基因扩增（拷贝数）基因重排（强启动子或增强子）插入突变DNA去甲基化ras基因信号转导蛋白myc基因加速细胞生长bcl-2基因细胞凋亡抑癌基因发现二次打击学说：遗传性视网膜母细胞瘤发生需要基因组发生了两次突变，第一次：亲体遗传，第二次：体细胞突变。定义指一类存在于正常细胞内、调控细胞生长的基因，具有潜在的抑癌作用。突变失活后，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。分类编码产物为转录因子编码产物为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白参与DNA修复后的复制产物在细胞膜外表面产物在细胞膜内信号转导途径抑制因子Rb基因视网膜母细胞瘤基因低磷酸化：抑制高磷酸化：失活E2Fp53基因酸性区：促进转录核心区：结合DNA（特异）碱性区：四聚化结合DNA（非特异）功能：抑制细胞增殖；促进DNA修复；诱导细胞凋亡；诱导细胞分化。p16nm23功能调控细胞增值细胞周期蛋白（cyclin）细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白（CDKI）肿瘤发生基因诊断和基因治疗基因诊断内容直接诊断（致病基因）简介诊断（基因连锁分析）分子基础技术DNA测序核酸印迹杂交技术PCR技术DNA芯片技术特点特异性强灵敏度高早起诊断取样方便安全高效应用广泛分类遗传病肿瘤传染性疾病法医学基因治疗内容基本条件传统治疗不佳DNA水平上已阐明，且目的基因已克隆可在体外操作低水平有效不需严格控制方案严格审批基本程序目的基因的选择与制备靶细胞的选择基因的导入病毒载体法非病毒载体法转染细胞的筛选和导入基因的鉴定主要策略基因修复基因置换基因增补基因干预反义核苷酸技术核酶技术RNA干扰技术自杀基因技术免疫基因治疗耐药基因治疗基因激活应用问题和展望