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分子克隆（基因工程）周坤福13914739863zhoukunfu@sina.com前言二十世纪40年代，基因分子生物学家确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA50年代，Waston和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制深刻意义在于：解决了基因自我复制和遗传信息的传递问题50年代末和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功破译了遗传密码。从而阐明了遗传信息的流向和表达问题DNAmRNA蛋白质转录翻译tRNA，rRNA逆转录复制这些都为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础基因工程的诞生70年代初，DNA限制性内切酶的发现和一整套DNA体外重组技术又为基因工程的发展奠定了坚实的技术基础。1972年，美国学者Berg.P等人首次在体外把SV40（一种猴病毒）的DNA和噬菌体DNA分别切割，又将两者接在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次将体外重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。基因工程这门新兴学科也就由此诞生了。基本概念基因工程的核心是重组DNA技术（recombinantDNAtechnique），又叫DNA克隆（DNAcloning）。所谓克隆（clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。在基因工程中所指的克隆，是指在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，并将重组分子导入适合的宿主细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。基本概念这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆（molecularcloning）。由于研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作基因克隆（genecloning）。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程（geneticengineering）。基因工程与当前发展的蛋白质工程、酶工程以及细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域——生物技术工程。生物技术工程的兴起为现代科学技术发展和工农业、医药卫生事业的进步提供了巨大动力。细胞克隆技术：在制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术中运用的最为充分。哺乳动物的克隆：克隆概念在个体水平上的应用采用了核质分离、细胞融合、体外培养及胚胎移植等技术主要内容①从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。②在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞），并与之一起增殖。④筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。⑤从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之实现功能表达。供体细胞目的基因载体重组DNA分子转化细胞受体细胞多肽药物疫苗、抗体基因治疗基因诊断转基因动物(畜牧业、渔业生物反应器)转基因植物(农业、林业生物反应器)冶金、环保轻工、食品应用实例重组DNA技术跨越天然物种屏障，将原核和真核生物，植物和动物，细菌和人，动物和人的基因连接起来，进行基因交流。利用大肠杆菌（E.coli)、酵母、哺乳动物细胞表达系统来生产人类所需要的，从其他方法又难以大量获得的重组蛋白质。1、第一个用细菌表达的用于人类的基因重组药物——人胰岛素上市（1979年美国基因技术公司）牛、猪胰岛素，免疫反应化学合成人胰岛素基因插入E.coli表达载体中-半乳糖苷酶基因后融合蛋白溴化氰水解混合重建2、用酵母细胞生产乙型肝炎病毒亚单位疫苗包膜蛋白核心蛋白病毒DNA乙肝病毒用基因工程方法制备乙肝表面包膜蛋白为抗原亚单位疫苗无致病力，很安全、高效。3、生物钢扫描电子显微镜下的蜘蛛单丝表面扫描电子显微镜观察下的蜘蛛单丝断面蜘蛛丝被拉断时显示出的“皮”结构，也称鞘结构（箭头所示部分）蜘蛛丝被拉断时显示出的芯结构，也称剑结构（箭头所示部分）目前世界范围内开发的基因工程多肽药物、疫苗、抗体有五百多种理论意义1、彻底填平了生物种属间不可逾越的鸿沟2、重组技术缩短了进化单位3、能按人们的意愿定向改造、培育新品种4、解决医学与生物学上长期无法解决的许多重大（如是什么基因、在什么地方、什么时间、起什么作用？如何起作用？）人们预言，21世纪是生命科学的世纪，以基因工程为主导的生物技术可能对世界的重大问题－－饥饿、疾病、能源、污染等提出切实的解决办法，推动社会生产力的飞速发展。一、分子克隆中常用的工具酶在重组DNA与基因工程中，对目的基因的分离、剪切和重组涉及到一系列酶催化反应，这些酶就像外科医生的手术刀一样，是进行基因工程操作必不可少的工具。常分为限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）、连接酶（ligase）和核酸修饰酶（modifyingenzyme）。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是指能识别DNA的特殊序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶。它主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速降解，而对细菌自身的DNA，则通过甲基化酶在该种限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的DNA不被降解。限制性内切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。限制性核酸内切酶的命名命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个斜体字母的缩写表示。第一个大写字母取自细菌属名的第一个字母；第二、三个小写字母取自微生物种名的头两个字母；第四个字母代表该微生物同种内不同的株系；如果同一株名发现几种限制酶，则根据其被发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示。例如，从大肠杆菌（EscherichiaColi）RY13株中发现分离的第一种限制酶，称为EcoRI。限制酶的分类及特点根据限制酶的组成、辅因子及切割DNA方式不同，可分为I、II、III型。重组DNA技术中常用的是II型限制性内切酶。II型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5‘端为磷酸基，3’端为羟基。识别顺序一般为4－6个碱基，通常是回文结构（palindrome）。识别序列的大小决定其切割DNA后产生的片段的长短。44＝256、46＝4096、48＝65536II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口：⑴在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（blintend），如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3‘3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'⑵在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5'端切割产生5'端突出的粘性末端，如EcoRI：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'⑶从3'端切割产生3'端突出的粘性末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3‘3'…G▲ACGTC…5'3'…GACGTC…5'同工异源酶1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnIGGTACCSstICCGCGGAsp718GGTACCSacICCGCGG同尾酶有些限制酶识别序列不同，但产生相同的粘性末端，称这些酶为同尾酶。如：BamHI(GGATCC)和Sau3AI(NGATCN)由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性5‘…G▼AATTC…3’5‘…N▼AATTN…3’星号活力EcoRI*星号活力：限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异性识别顺序类似的序列，这种现象称星号活力。诱发星号活力常见原因：1、高甘油含量（5%，V/V）2、内切酶用量过大，（100U/µgDNA）3、低离子强度：25mmol/L4、高pH值：pH85、含有机溶剂：二甲基亚砜、乙醇、乙烯二乙醇等6、有Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+等非Mg2+的二价阳离子。。应用在分子生物学和基因工程中具有举足轻重的地位。其主要胜用途：1、改造及组建质粒2、组建基因组DNA物理图谱3、基因组DNA同源性研究4、DNA重组克隆及亚克隆5、DNA杂交与序列分析注意事项1.酶切底物DNA要纯，抽提时酚／氯仿要去除干净。2.所加酶量不应超过10％（RE保存在50％的甘油中－20度较稳定）。3.取酶时量要准，最后加酶，最好在冰箱里加。4.酶切反应2小时左右，可延长，节约酶量。5.两种酶有相同的缓冲液，可双酶切；不同，先用需低盐缓冲液的限制酶消化，再用需高盐缓冲液的酶消化。DNA连接酶连接酶可催化DNA分子中相邻5'磷酸基和3'羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。常用的有T4（噬菌体）DNA连接酶和E.ColiDNA连接酶。DNA聚合酶重组DNA技术中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA为模板在体外合成DNA或RNA。可分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链RNA作为杂交探针。常用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(klenow)以DNA为模板，催化5‘→3’核酸链的延长，另有3‘→5’的外切酶活性。常用于DNA3‘末端的标记和填充；cDNA第二链的合成，DNA测序。磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase,CIP），催化DNA或RNA的5'磷酸基水解。常用于去除线状载体DNA两端的5'磷酸基团，防止载体自身连接环化；也用于用32P标记DNA的5'末端之前除去原来的5'磷酸基。逆转录酶以RNA为模板，合成cDNA链（5'→3'），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一，二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。名称功能及应用大肠杆菌DNA聚合酶I以DNA为模板，催化5’→3’核酸链的延长，另有3’→5’的外切酶大片段（klenow）活性。常用于DNA3’末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、DNA测序。TaqDNA聚合酶以DNA为模板，催化5’→3’核酸链的延长，另有弱的5’→3’的外切酶活性，耐高温。常用于PCR及DNA测序。末端转移酶催化NTP中的NMP通过其磷酸基与DNA3’-OH连接而使DNA链延长，无需模板。常用于3'端标记或形成DNA共聚尾巴。逆转录酶以RNA为模板，合成cDNA链（5’→3’），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链RNA作为杂交探针。二、分子克隆中常用的载体基因工程载体（vector）是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。什么样的载体才是较为理想的呢？其基本条件是：①能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。②具有适当的限制性酶切位点，以便目的基因的插入。③载体分子大小合适，太大不易复制；太小不易容纳较大目的基因。④具有合适的筛选标记（如抗药性基因，酶基因等），以便筛选阳性克隆。⑤如作为表达载体，要配备适当的调控元件，如启动子、增强子等。载体的分类一般常用的载体按来源分有质粒（plasmid）、噬菌体（phage）和病毒（virus）。天然的质粒、噬菌体、病毒都需经过人工改造才能成为合乎要求的基因工程载体。质粒和噬菌体常用于以原核细胞为宿主的分子克隆；动物病毒常用于以真核细胞为宿主的分子克隆。载体按得到的产物分类：克隆载体（cloningvector）主要用于DNA大量扩增，并不需要得到目的基因所编码的蛋白质。表达载体（expressionvector），使插入的目的基因可转录、进而翻译成多肽链而设计的载体，具有表达外源基因的能力。质粒载体染色体质粒质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给