分子生物学7-核酸分子杂交

周坤福核酸分子杂交（nucleicacidmolecularhybridization）•是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。•杂交双方分别称为探针与待测核酸。•杂交分子：杂交后形成的异源双链分子核酸分子杂交技术•是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。•是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测DNA或RNA序列片段的有力工具。•核酸探针(probe)：带有可检测标记的已知序列的互补DNA或RNA片段。通常用核素或非核素示踪标记。第一节核酸分子杂交的基本原理第二节核酸探针第三节核酸分子杂交技术第一节核酸分子杂交的基本原理•具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。一、变性（denaturation）2．变性的因素：加热、酸、碱、某些理化试剂（如尿素、甲酰胺）增色效应（hyperchroniceffect）：核酸变性时，紫外吸收值A260随之升高的现象。1．概念：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，有规则的结构被破坏，双股螺旋（NDA）或发夹结构（RNA）打开，形成单链分子。变性的因素•除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主要的是DNA分子中GC的含量，GC含量高的DNA不易变性，而AT含量高的DNA容易变性。•另外环状DNA比线性DNA难于变性。3.常用变性方法(1)热变性DNA的熔解曲线Tm值（meltingtemperature）:热变性时，50%DNA分子变性的温度。又叫解链温度、熔解温度。Tm=(G+C)%×0.41+69.3热变性•当温度＜70℃，DNA几乎不变性；•当温度介于70～90℃时，DNA部分变性；•当温度＞90℃，DNA完全变性；•当温度＞100℃，DNA双链分离；•通常核酸的变性温度可选在90～100℃之间。(2)酸碱变性•当核酸溶液的pH低于3或高于10时，核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子；•在分子杂交中最常用的核酸变性方法是碱变性（因为核酸的载体物如凝胶或膜对热不稳定）(3)化学试剂变性•当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲酰胺、甲醛等时，双链间的氢键可以断裂形成单链核酸分子二、复性（renaturation）概念：在适当条件下，变性DNA的两条互补单链通过碱基互补配对原则重新缔合，形成双链的过程（又称杂交）。热变性后，缓慢降低温度至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA可恢复其双链结构，称为退火（annealing）。相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸顺序的两条核酸链之间，如DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA或人工合成的寡核苷酸片段与DNA、RNA等。单链核酸的起始浓度核酸链长度（分子量）核酸分子的复杂性，即核酸分子中不同序列的总长度温度离子强度影响复性的因素：三、杂交（hybridization）2．影响核酸分子杂交的因素：•核酸分子的浓度和长度•温度•离子强度•变性剂（甲酰胺）•核酸分子的复杂性•非特异性杂交反应1．概念：来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA杂交分子。杂交温度：–温度一般选择低于Tm值20-25℃–Tm=81.5℃+161.6logM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺%）–M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性例如，一个长度为500bp的探针，（G+C）含量为50%，杂交体系中含5XSSC（0.75mol/LNa+）和50%甲酰胺，则其Tm值为：Tm=81.5℃+(-2.07)+20.5–1–30.5=68.4℃杂交温度应:68.4℃-25℃=43.2℃–实际的杂交反应中，水溶液：杂交反应温度为68℃–50%甲酰胺溶液：杂交反应温度为42℃甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核酸杂交的Tm值，50%的甲酰胺可以使Tm降低30℃寡核苷酸探针杂交反应Tm=4℃×G+C）+2℃×（A+T）杂交反应温度为Tm-5℃变性、复性、杂交示意图变性复性探针四、预杂交（prehybridization）1．概念：为了减少探针与膜等的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭，该过程称为预杂交。2．常用的封闭物：（1）变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA，又称为覆盖DNA。（2）高分子化合物：一般常用Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯烷酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400第二节核酸探针probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。核酸探针的类型核酸探针的标记方法核酸探针的检测按化学本质分：DNA探针RNA探针按标记物分：放射性标记探针非放射性标记探针按分子大小分：寡核苷酸探针双链探针单链探针核酸探针的类型双链探针：包括基因组DNA探针和cDNA探针基因组DNA探针：由基因组文库筛选…标记cDNA探针：由cDNA文库筛选…标记或者经RT-PCR法生成，mRNA→cDNA链→PCR扩增寡核苷酸探针：常为18-30bp单链探针：包括单链DNA探针和单链RNA探针。核酸探针标记方法放射性同位素的选择：•32P优点：放射比活度高缺点：半衰期短（14.3D）、散射严重•35S优点：分辨率较高，半衰期长（87.4D）放射比活度高缺点：放射比活度只有32P的1/6•3H优点：半衰期长（12.3Y）、成像分辨率高，易于定位缺点：活性低放射性标记核酸探针：32P或35S同位素标记的单核苷酸（α）（γ）（OH）HOH制备均一标记的DNA探针（1）缺口平移法（nicktranslation）由DNA酶Ⅰ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。DNA酶Ⅰ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-OH端大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’外切核酸酶活性随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段：5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性无5’→3’外切核酸酶活性（2）随机引物法（randompriming）单链探针的标记单链DNA探针：利用M13噬菌体载体合成以dsDNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶于体外转录合成，用无RNase的DNA酶Ⅰ处理，除去模板DNA单链RNA探针：探针的末端标记在5’或3’端通过酶促反应加上标记物•DNA聚合酶ⅠKlenow片段标记法•T4DNA聚合酶标记法•T4多核苷酸激酶标记法•末端脱氧核苷酸转移酶标记法：ddNTP为底物DNA聚合酶ⅠKlenow片段标记法T4DNA聚合酶标记法T4多核苷酸激酶标记法ATPADPγ32P非放射性标记核酸探针生物素化核苷酸1.生物素(biotin)标记标记方法：（2）光敏生物素标记法：强光10-20分钟光敏生物素的结构（1）酶促标记法：缺口平移法、随机引物法、末端标记法（T4DNA聚合酶标记法不能使用）2．地高辛(digoxigenin)标记法dig-dUTP的结构酶促标记法：dig-dNTP缺口平移法、随机引物法、末端标记法（T4DNA聚合酶标记法不能使用）核酸探针检测方法同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来检测杂交信号。取出杂交膜，在Whatman滤纸上晾干，用保鲜膜包好，在暗室中置于X线片上，加增感屏，固定于暗盒内，-70℃曝光适当时间（1-7天），在暗室中取出X线片，显影、定影，即可在X线片上读出杂交带。非放射性标记探针：酶联显色Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联Dig-DNA探针+抗Dig抗体-碱性磷酸酶（或辣根过氧化物酶）+底物（1）偶联反应生物素：可与抗生物素蛋白（卵白素）或链亲合素结合，再与显色体系偶联•生物素探针+抗生物素蛋白-酶+底物•生物素探针+抗生物素抗体+抗生物素抗体的抗体-生物素+ABC试剂（2）显色反应酶法：通过酶促反应使其底物形成有颜色的反应产物碱性磷酸酶：BCIP（5-溴-4氯-3吲哚磷酸盐-4-甲基胺蓝）NBT（四氮唑蓝）辣根过氧化物酶：DAB（二氨基联苯胺）→红棕色TMB（四甲基联苯胺）→蓝色第三节核酸分子杂交技术膜上印迹杂交核酸原位杂交一、膜上印迹杂交印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固相支持物上的方法。指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。1．固相支持物的选择特点：较强的结合核酸的能力;与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应;与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不脱落;非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉;具有良好的机械性能常见的固相支持物：硝酸纤维素膜（nitrocellulosefiltermembrane）：尼龙膜（nylonmembrane）：化学活化膜：聚氟偏乙烯膜（PVDF膜）2．印迹方法虹吸印迹法真空转移法电转移法直接点印法（斑点、狭缝；菌落或噬菌斑）（1）虹吸印迹法DNA片段1kb，1小时DNA片段15kb，18小时（2）真空转移法30~60分钟（3）电转移法不宜用硝酸纤维素膜一般2~3小时，最多6~8小时3．印迹类型•Southern印迹杂交•Northern印迹杂交•斑点及狭缝印迹杂交•反向斑点杂交•菌落或噬菌斑杂交提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜，高温烘烤与DNA或RNA探针杂交放射自显影Southernblottinghybridization检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因。可用于基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。预杂交预杂交：杂交袋，42℃或68℃水浴，轻微振荡4-12小时预杂交液：6×SSC、0.5%SDS、5×Denhardt’s液、100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。杂交：杂交袋，42℃或68℃水浴，轻微振荡杂交液：6×SSC、0.5%SDS、5×Denhardt’s液、100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA、变性的探针。洗膜：取出杂交膜，按先高盐后低盐溶液进行漂洗。室温，2×SSC、0.1%SDS中洗膜2次/15分钟，轻微振荡68℃，0.2×SSC、0.1%SDS中洗膜2次/10分钟，轻微振荡洗去未结合的、游离的探针，可能非特异性结合的DNA与SouthernBlot不同的是：1.不需要限制性核酸酶切;2.变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。Northernblottinghybridization检测靶分子为RNARNA极易被环境中存在的RNase降解，提取时要特别注意RNase污染问题。直接将变性DNA样品点于NC膜上，固定好后先预杂交，再与探针杂交。确定DNA样品之间的同源性或者两个克隆DNA片段是否来源于同一DNA样品。dotandslotblottinghybridization优点：简单、迅速可在同一张膜上进行多个样品的检测核酸粗提样品的检测效果也较好dotblottinghybridizationslotblottinghybridizationreversedothybridization直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断DNA是否含有这些探针的同源序列。DNA芯片（DNAchip）：•1995年斯坦福大学地SchenaM和BrownPO等发表第一篇基因表达阵列芯片，之后国内外兴起了一股微点阵（microarrays）技术——DNA芯