“生物大分子分离纯化及检测”试题

2005级硕士研究生“生物大分子分离纯化及检测”试题专业____________________姓名____________________学号____________________一、简述或解释（70分）1、电渗？逆回效应？肽图？电泳迁移率？（8分）电渗即电解质在电场中的相对位移。原因：固体支持物与溶液中会形成双电层，在电场作用下会是电解质进行相对位移，我们称之为电渗。电渗与固体支持物本身的性质有关。在对流免疫电泳中利用电渗效应，而在其他电泳中尽量消除电渗作用。逆回效应：分析样品为血清蛋白时，虽电泳时间的不同，可得到不同的电泳图谱，在20个小时的电泳过程中，分离区带的顺序也会发生变化，称逆回效应。原因：样品中含有电解质，在电泳过程中，由于电解质的存在，样品各成分所带的实际电荷发生改变，从而造成某种成分移动方向的改变，而表现出逆回效应。如果将血清样品先对所用电泳缓冲液进行透析，就不会出现逆回效应，各条区带的移动与时间呈线性关系。电泳迁移率：在一定电场下，带电质点的迁移速度。U=Q/6hrpai.2、测定蛋白质等电点方法的基本原理？（6分）在等电聚焦电泳中，由于载体两性电解质在电场作用下形成PH梯度，加入样品蛋白质以后，由于蛋白质所带电荷的性质及程度不同，在电泳过程中就会向不同的方向（与其带相反电荷的方向）移动，当蛋白质移动到与其等电点相等的PH区域时，由于蛋白质本身所带净电荷为0，故停止移动，因此在电泳结束后蛋白质所在位点的环境PH就是蛋白质的等电点。3、狭义亲和层析的基本原理？（5分）狭义亲和层析基本原理：生物大分子之间有一种特异的相互作用，比如：抗原-抗体、酶-底物、配体-受体等等。将其任何一方固定来分离纯化另一方（通过特异相互作用结合，改变环境条件使分离纯化成分解离）。4、离子交换层析的洗脱方法及方式？（6分）离子交换层析的洗脱方法：⑴、改变起始缓冲液的PH，是牢固吸附状态的组份变为有限吸附状态或完全解吸状态。⑵、增加起始缓冲液的离子强度（加中性盐、缓冲盐等），以增加洗脱液的洗脱能力。⑶、改变起始缓冲液PH的同时，增加其离子强度，以增加洗脱液的洗脱能力。5、对流免疫电泳基本原理？（5分）对流免疫电泳的基本原理：环境的PH为免疫球蛋白的PH左右，但由于琼脂糖凝胶作为介质，产生电渗作用。使抗原在电场中移动的同时，由于受到电渗作用的影响，本不移动抗体在介质中发生与抗原的相向移动。6、电泳结果检测时，单纯蛋白的三种染料、糖蛋白的一种染料、脂蛋白的两种染料？（3分）在电泳结果检测时，单纯蛋白的三种染料：萘黑12B、苯胺黑、溴酚蓝、丽春红，糖蛋白的一种燃料：schiff’s试剂，脂蛋白的两种种染料：苏丹黑B、油溶红O。7、测定蛋白质分子量的四种方法？（4分）测定蛋白质分子量的四种方法：葡聚糖凝胶层析、SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶层析、聚丙烯酰胺凝胶层析。8、疏水层析和反相层析的异同点？（8分）疏水层析：以C8、苯、C4等烃链作为功能基团共价偶联到水不溶性载体上而制得的亲和层析填料，利用生物分子表面疏水性的强弱差异而分离纯化的方法。反相层析：一般以水以及与水互溶的有机溶剂作为流动相，流动相的极性大于固定相的极性。在反相层析中，在洗脱液中加入一些与与分离组分带相反电荷的离子试剂，这些离子试剂与欲分离纯化组分结合后使其总的亲水性增加或是疏水性增加。相同点:流动相极性大于固定相极性。不同点：一、固定相的非极性，反相层析大于疏水层析；二、洗脱液反相层析用的是水或与水互溶的有机溶剂，而疏水层析用的是中性盐。9、凝胶层析的基本原理？凝胶层析的组别分离、分级分离？两者最大上样量？（7分）凝胶层析的基本原理：分子筛效应，用具有一定孔径的多孔凝胶作为支持物，例如交联葡聚糖凝胶及其衍生物、琼脂糖凝胶及其衍生物、聚丙烯酰胺凝胶及其衍生物等，以水溶液作为流动相，依据分离组分的分子量大小不同而使其相继被洗脱下来。凝胶层析的组别分离：A、将大分子与小分子分离，原则：是大分子处于完全排阻状态。B、样品脱盐，由于样品中盐对实验的干扰，使组分处于全排阻状态脱盐。C、电泳或离子交换时溶剂交换。分级分离：样品中含有很多组分，分子量之间有一定的差异，但又达不到组别分离，试验的目的是将其分离。选用排阻限度略大于样品中最高分子量组分的凝胶，在层析过程中，组分能不同程度的渗透到凝胶内部，由于分配系数kd的不同，最后可能得到分离（kd达到分离要求）。两者最大上样量：组别分离，上样体积为柱床体积Vt的25﹪-30﹪，分级分离上样体积为柱床体积的1﹪-4﹪。10、聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理、用途、优点？（10分）聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理：通过控制单体（丙烯酰胺）及胶联剂（甲叉双丙烯酰胺）浓度及二者比例可以合成具有一定孔径的凝胶，用于电泳作为介质，可以集合分子筛效应及荷质比效应，从而达到组分的分离。用途：鉴定、定性、定量、小量制备、理化常数的测定（分子量及等电点）。优点：一、样品不易扩散；二、可以随意控制胶联度，根据需要制备不同孔径大小的凝胶；三、有分子筛效应和荷质比效应结合，分辨率更高；四、理论上，制备的聚丙烯酰胺凝胶本身不带电荷，电渗作用非常低；五、实验的重现性很高；六、机械强度好，有弹性，在一定的浓度范围内是透明的；七、需要的样品量少，一般1-100ug；八、用途广泛。11、写出四种可用于薄层电泳和薄层材料的名称？（4分）无机物：氧化铝、磷酸钙、硅胶、硅藻土等；有机介质：尼龙、纤维素、葡聚糖等。12、SDS-PAGE中影响SDS结合程度的因素？（4分）SDS-PAGE中影响SDS结合程度的因素：一、SDS的浓度，SDS的浓度不同，其与蛋白质的结合比不同。二、样品本身，例如糖蛋白就不易与SDS结合，使实际迁移率比正常理论只要小。三、SDS本身，其纯度也可能影响其与蛋白质的结合程度。二、根据下列各蛋白质组分的已知参数，从理论上设计实验放案，将各组分分离纯化至单组分。（详细叙述所采用的分离纯化实验方法名称、实验主要步骤、实验基本条件、实验预期结果、所得各组分纯度分析及分子量和等电点的检测方法）（30分）分子量（kDa）等电点疏水强度ProteinA25.08.0强ProteinB23.54.5强ProteinC90.07.9中ProteinD85.54.3强ProteinE25.88.2弱ProteinF89.04.4弱可选择的实验材料1、层析介质（填料）：sepharoseFF(fastflow)特点，可用有机溶剂，流速交胶链琼脂糖凝胶快或在相同流速下分辨率比交联琼脂糖凝胶高，去电荷处理，非特异性极低，收率提高。Sephadex除了用水、盐作为洗脱液以外，可用极性有机溶剂。DEAE（二乙基氨基乙基，弱碱性，PH8.6，使用最广泛的阴离子交换剂，主要用于中性和酸性生物大分子，当PH8.6时，结果很难重现）—Sepharose（琼脂糖凝胶）FF（稳定，在位消毒），属凝胶离子交换剂双重作用，即标准离子交换作用和凝胶的分子筛效应；CM（羧甲基纤维素，广泛应用的阳离子交换剂，适用于中性和碱性生物大分子，要求溶液PH4.0）—SepharoseFF；SP(磺丙基)—SepharoseFF；Q—SepharoseFF；DEAE—SephadexA25；CM—SephadexC25；DEAE—SephadexA50；CM—SephadexC50；最大缺点，环境盐浓度或PH变化都会使交换剂的容积发生变化，都属软胶，流速慢，容积收缩，难评估。Phenyl—（苯）Sepharose6FF（属疏水层析）；Octyl—Sepharose6FF；SOURCE15RPC；SephadexG-50（30~1.5kDa）；SephadexG-75（80~3kDa）；SephaeryS—100HR（100~5kDa）；Superdex75prepgrade（70~3kDa）；Superdex30prepgrade（≤10kDa）；此区域属凝胶层析（分子筛效应，依据分子量大小进行分离）2、试剂：SDS；Tris；HCL；Gly；Na2HPO4；NaH2PO4；蛋白质染料；NaOH；(NH4)2SO4；甲醇；乙腈；冰HAc；H3PO4；NaCl；丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；过硫酸胺；TEMED；Ampholines(pH3—10)3、层析柱：1.6x25cm；1.6x80cm；2.6x20cm；2.6x70cm；1.6x40cm；1.6x100cm方法：首先依据分子量差异进行初步分离，proteinC、proteinF分子量相近，作为混合成分洗脱出来；proteinA、B、E分子量相近，作为混合成份洗脱出来；proteinD单独洗脱出来可得到单体成份。选用葡聚糖凝胶层析SephadexG-50(30-1.5KD)。然后进一步根据疏水强度分离，由于proteinC的疏水强度中强，而proteinF的疏水强度弱，故可用疏水层析Phenyl-Seharose6FF分离得到各自的单体。而proteinA、B的疏水强度强，而proteinE的疏水强度弱，故proteinA、B作为混合组分洗脱出来，而proteinE由于疏水作用弱而作为单体成份被洗脱下来。最后，依据proteinA、B所带电荷的性质及程度的差异将proteinA、B各自作为单体分离出来，选用的凝胶离子交换剂是DEAE-SephroseFF.蛋白质分子量的测定，SDS-PAGE法（不连续），所用试剂：HCL,CL离子是前导离子，Gly是尾随离子，Tris是缓冲平衡离子；SDS；丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；过硫酸胺；TEMED（胶的聚合过程，，氧化还原体系）；在前面溶液进行脱气处理（减压不加热）以后，加一定量的催化剂或加速剂，混合计时，迅速制备分离胶，30-60min内使分离胶聚合完成。等电点的检测方法：等电聚焦法，载体两性电解质，试剂Ampholines(PH3-10).二00七级硕士研究生“生物大分子分离纯化及检测”试题专业____________________姓名____________________学号____________________一、简述或解释（80分）1、测定蛋白质等电点方法的基本原理？2、狭义亲和层析的基本原理？3、离子交换层析的洗脱方法及方式？4、对流免疫电泳基本原理？5、电泳结果检测时，用于蛋白质染色的5种染料？6、用于测定蛋白质分子量测量的的两种方法(层析和电泳)的基本原理？7、疏水层析和反相层析的异同点？8、凝胶层析的组别分离、分级分离？9、聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理、用途、优点？二、根据下列各蛋白质组分的已知参数，从理论上设计实验放案，将各组分分离纯化至单组分。（详细叙述所采用的分离纯化实验方法名称、实验主要步骤、实验基本条件、实验预期结果、所得各组分纯度分析及分子量和等电点的检测方法）（20分）分子量（kDa）等电点ProteinA25.08.0ProteinB23.54.5ProteinC90.07.9ProteinD85.54.3ProteinE25.88.2可选择的实验材料1、层析介质（填料）：DEAE—SepharoseFF；CM—SepharoseFF；SP—SepharoseFF；Q—SepharoseFF；DEAE—SephadexA25；CM—SephadexC25；DEAE—SephadexA50；CM—SephadexC50；Phenyl—Sepharose6FF；Octyl—Sepharose6FF；SOURCE15RPC；SephadexG-50（30~1.5kDa）；SephadexG-75（80~3kDa）；SephaeryS—100HR（100~5kDa）；Superdex75prepgrade（70~3kDa）；Superdex30prepgrade（≤10kDa）；2、层析柱：1.6x25cm；1.6x80cm；2.6x20cm；2.6x70cm；1.6x40cm；1.6x100cm3、试剂：各种化学试剂