分子生物学在检验医学中的应用

分子生物学在检验医学中的应用一、分子生物学在检验医学中的常用技术•1、PCR技术•2、RT-PCR技术•3、RFLP•4、SSCP•5、MSP•6、测序二、外源性疾病的检验与诊断：•1、细菌、支原体、衣原体、寄生虫、•病毒等•2、SARS冠状病毒的分子生物学检测BNIoutS/BNoutAs:senseATGAATTACCAAGTCAATGGTTACantisenseCATAACCAGTCGGTACAGCTACFraGmentlenGth195bpBNIinS/BNIAs:senseGAAGCTATTCGTCACGTTCGantisenseCTGTAGAAAATCCTAGCTGGAGFragmentlength110bpSAR1s/SAR1as:senseCCTCTCTTGTTCTTGCTCGCAantisenseTATAGTGAGCCGCCACACATGFragmentlength150bpAmpliconsequence(BNI-1,Bernhard-NochtInstitute,Hamburg,Germany)TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACCSARS-specificprimers:Cor-p-F2(+)5'CTAACATGCTTAGGATAATGG3',Cor-p-F3(+)5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC3',Cor-p-R1(-)5'CAGGTAAGCGTAAAACTCATC3',Productsize:Cor-p-F2/Cor-p-R1:368bpCor-p-F3/Cor-p-R1:348bpGovernmentVirusUnit9/FPublicHealthLaboratoryCentre382NAmCheongStreetShekKipMeiKowloon,HongKongSARHongKong-SARChinaCOR-1,COR-2:sense5'CACCGTTTCTACAGGTTAGCTAACGA3'antisense5'AAATGTTTACGCAGGTAAGCGTAAAA3'Productsize:310bpQueenMaryHospitalTheUniversityofHongKongUniversityPathologyBuildingHongKong-SARChinaHKU:sense5'TACACACCTCAGCGTTG3'antisense5'CACGAACGTGACGAAT3'Productsize182bps二、内源性疾病的检验与诊断：•1、临床基因变异酶的分子性质研究••1）用PCR-SSCP技术发现我国第一例•LDH遗传变异病例病例21岁男性：LDH：75U/L(参考范围：110-240U/L)其余指标均正常在三年的调查期间，LDH活力始终处于较低水平，在48-85U/L之间经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。2n23n34n45n56n62）LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及对检验结果的影响基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊。LDH-A基因变异类型_________________________________________________变异位置DNA氨基酸置换影响—————————————————————————A-171CGA-TGAArg-Ter无义突变A-328GAG-TAGGlu-Ter无义突变A-81GAC-AACAsp-Asn外显子2丢失A-220AAA-GAALys-Glu电荷变化A-314CGT-TGTArg-Cys电荷变化A-20插入C移码突变A-128TGTTGT-TGTValVal-Val辅酶结合A-213丢失2bp(CT)移码突变A-251丢失20bp移码突变—————————————————————————LDH-B基因变异类型变异位置DNA氨基酸置换影响B-6AAA-GAALys-Gly电荷变化B-35GCC-GAGAla-Glu辅酶结合B-1038bp重复移码突变B-131AGT-CGTSer-Arg辅酶结合B-139丢失2bp(TC)移码突变B-1454bp重复移码突变B-147TAT-TAGTyr-Ter无义突变B-171CGC-CCCArg-Pro基质结合B-172TTT-GTTPhe-Val基质结合B-173CGC-CACArg-HisP轴的安定性B-176ATG-TTGMet-Leu分子稳定性B-287丢失1bp(C)移码突变B-320GAT-GTTAsp-Val电荷变化3)CK变异的分子性质及对酶活力的影响病例56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科心电图和临床症状提示AMI实验室检查：LDH6900U/L(200-400U/L)LDH-1/LDH-21.72CK37U/L(15-130U/L)CK-MB0U/LRT-PCR结果外显子2残基54处A–GGAC–GGC天冬氨酸–甘氨酸位于酶结构的第4个α-螺旋4）变异酶人群的检验结果不同于常规人群的检验结果结合临床研究发现变异酶的检验结果与常人存在着显著的差异，即这类人群发病前酶活力常低于正常人的参考范围，发病时则上升至正常人的参考范围之内，这个现象可能给临床医生正确诊断造成困难；1）2、2、电泳异常带的分子性质研究1）LDH异常电泳酶谱M4H1M3H2M2H3M1H4(+)LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1︱︱︱︱︱正常︱H缺失︱M缺失︱︱︳︱︳︱︳︱︳H变异(slow)︱︱︳︱︳︱︳︱︳H变异(fast)H发生变异时，产生H和hM4H1M3H2M2H3M1H4LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1︱H1M3h1M3H2M2H4h2M2h1H3hHM2h2H2h3H1h42）异常电泳酶谱的分子性质1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变，2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同，3）变异的氨基酸位于分子的表面。结果：产生异常的电泳结果3）异常谱形的分析方法LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图血清（浆）同工酶分析（异常形式）红细胞、白细胞同工酶分析正常谱型异常谱型免疫对流、固定、混合法鉴定遗传变异（H或M亚基变异）（+）（-）LDH-Ig复合物肿瘤产生LDH基因分析LDHH/M比值的计算--------------------------------------------------------LDH-1LDH-2LDH-3LDH-4LDH-5H亚基数43210M亚基数01234%ABCDE-------------------------------------------------------------------------------------------计算方法：H=A+3/4B+2/4C+¼DM=100-HH/M=H/(100–H)2、后生性调控标志物1、DNA甲基化-后生性调控的主要方式DNA甲基化是不改变基因序列，而是通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，从而调节基因的表达。2）启动子甲基化作为新的分子诊断标志物的研究3）启动子甲基化在分析LDH异常带分子性质中的首例应用病例4岁儿童遗传性Rb转移到颈淋巴结血清LDH升高异常同工酶带LD2ex位于LD1和LD2之间□□□□□□□□□□□□□□□□DNAmRNA1mRNA2aa0012345671234567