搜索
分子生物学基本技术—PCR(PolymeraseChainReaction)huahua2125@163.comPCR(PolymeraseChainReaction)一、历史及其发展二、PCR的基本原理三、Primerdesign引物常规设计原则四、PCR反应体系五、PCR反应条件优化（PCRoptimization)六、PCR反应特点七、PCR产物的分析八、Molecularmarker九、PCR技术的应用分子生物学技术体系基本技术基因及产物分子检测技术基因及产物获取技术基因功能研究技术基本技术1.琼脂糖凝胶电泳2.SDS-PAGE电泳3.PCR技术4.细菌转化聚合酶链式反应-----PCR(PolymeraseChainReaction)一、历史及其发展：1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。1993年：Mullis与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家MichaelSmith共获诺贝尔化学奖KaryMullis&MichaelSmith穆利斯（KaryMullis）美国化学家1944～史密斯（MichaelSmith）加拿大化学家1932～二、PCR的基本原理☺PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制☺PCR三步曲Threesteps：Denaturation变性90～97℃Primerannealing退火45～55℃Polymerization延伸72℃原理5’3’3’5’类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。回忆：DNA的复制……DNA解旋解链合成引物子链延长ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶回忆：DNA的复制……RNA引物RNA引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’引物酶引物酶DNA解旋解链合成引物子链延长回忆：DNA的复制……ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3’DNA聚合酶DNA聚合酶回忆：DNA的复制……变变变变变变90变95变40变60变70变75变PCR简要过程图解PCR详细过程图解1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍模板DNA95℃150℃引物1引物2DNA引物2引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶3第1轮结束95℃第2轮开始472℃TaqTaqTaqTaq5PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增三、Primerdesign引物常规设计原则1.长度：15-37nt,一般20nt左右;(仅binding,不含接头)2.G+C含量40％～60％，而且四种碱基的分布最好随机。3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；4.引物自身不能互补（3个）5.引物之间不能互补（5个）6.引物３端不能错配,不能修饰，尽量不用T,不能超过３个连续的G或C；7.５端可变化修饰，附加酶切位点；8.两引物的Tm值应比较接近；9.正链引物：mRNA序列照抄；负链引物：先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写。10．解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T)[=20nt]Tm=81.5+0.41*(GC%)-600/L[20nt]Tm一般５５℃～８０℃［５５℃～５８℃最佳］PCR反应中结合温度（anneaningtemperature）T=Tm-5℃P+、P-的设计方法四、PCR反应体系标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulTemplate（模板）：ssDNA,dsDNAmRNAneededtobeRTascDNA模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。Primes（引物）：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，增加二聚体的机会。纯化引物在25％乙腈溶液中4℃；冻干引物于-20℃可保存1-2年，液体状态于-20℃可保存6个月。不用时应-20℃保存。dNTPs：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。Mg2+：forTaqpolymeraseactivityMg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。Buffer：10-50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)。TaqDNApolymerase（TaqDNA聚合酶）：浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。分离:1969年，美国黄石国家公园温泉分子量:94KDa活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200000U/mg离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度50mmol/L。忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。TaqDNA聚合酶酶活性(%)40506070809010010080604020五、PCR反应条件优化（PCRoptimization)1、变性温度和时间一般情况下，92℃～95℃l-5min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。2、退火(复性)温度与时间引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55℃、1-2分钟。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。☺退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)3、延伸温度和时间☺温度：72℃，接近Taq酶的最适75℃，高于90℃时，DNA合成几乎不能进行☺TaqDNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60核苷酸/S/酶分子55℃24核苷酸/S/酶分子☺时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。一般：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的3～4kb的靶序列需3～4min10Kb需延伸至15min。☺延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。4、循环次数PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环过多，非特异性产物大量增加，循环次数决定PCR扩增程度。六、PCR反应特点1.特异性强：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。2.灵敏度高：PCR产物的生成量以指数方式增加3.简便、快速：PCR反应一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。4.对标本的纯度要求低：DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。七、PCR产物的分析☺1、凝胶电泳分析通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中。☺2、PCR产物电泳EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。目前可用SYBR的新型荧光染料来替代EB，从而减少了对环境的污染，并可有效保护实验操作者。☺3、酶切分析根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。☺4、分子杂交分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状。☺5、核酸序列分析是检测PCR产物特异性的最可靠方法。八、Molecularmarker1、传统水平：形态标记、细胞学标记、生化标记2、分子水平：☺第一类：电泳、分子杂交为核心代表：RFLP☺第二类：电泳、PCR为核心代表：RAPD、SSR、AFLP☺第三类：DNA序列为核心代表：单碱基多态性（SNP），DNA序列的单个核苷酸的差别3、应用种质资源研究品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定）构建遗传连锁图基因定位（QTL）标记辅助选择比较基因组研究基因克隆（图位克隆）生物起源、进化、医学及法医学（一）RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。自从人的RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。优点:共显性，非常稳定缺点：检测步骤多，周期长，费时、费钱；用作探针的DNA克隆制备、保存不方便；放射性同位素（二）RAPD（RandomAmplifiedPolymorphismDNA)RAPD随机多态性DNA扩增1、常规PCR