分子生物学基础

第二章动物生物技术的分子生物学基础一、遗传信息传递的方向―――中心法则逆转录病毒和逆转录酶美国病毒学家特明•蛋白质的生物活性氨基酸顺序特定的三维结构的完整性•遗传信息从基因转变成具有生物活性的功能蛋白质是通过两种“密码”介导：1.遗传密码，通过遗传密码将mRNA多核苷酸顺序译成线性多肽链；2.折叠密码（foldingcode）,其决定存在于氨基酸顺序中一维结构信息向蛋白质特定的三维结构的转变。•RNA多肽链蛋白质二、DNA的复制准确复制1、DNA复制从特定的位点开始酵母的自主复制序列（ARS）ATTTATPuTTTATAAATAPyAAAT2、半保留复制3、半不连续复制4、DNA复制具有高度的忠实性DNA聚合酶的自我校正功能5、多种酶和蛋白因子协同作用DNA复制的特点：1，复制起点θ复制或重新起始（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）双链环状DNA的复制眼可以形成一种θ结构，形状像希腊字母θ单向复制双向复制D环复制（Displacementform）又称置换式线粒体和叶绿体DNA的复制方式σ复制或滚环式复制（rollingcirclereplication）或共价延伸方式（covalenceelongation）由于复制时产生的滚环结构形状象σ，称σ复制病毒、细菌因子，如含有单链环状DNA的φX174、G4、M13线性DNA双链的复制单一起点、单向，如：腺病毒单一起点、双向，如：T7噬菌体多个起点、双向2、半保留复制•1958年，Meselson和Stahl证明DNA半保留复制。半保留复制是遗传消息能准确传代的保证。是物质稳定性的分子基础。StahlMeselson碱基的配对使得双螺旋DNA分子在复制时以半保留的形式进行。3、冈崎片段与半不连续复制（okazaki1968年）（OriCinE.colichromosomalDNA)大肠杆菌的DNA复制♦四个9bp的重复序列dnaA结合位点♦三个13bp的重复序列若干GATC位点*转录激活*DnaA识别并结合复制起点，DnaB－DnaC六聚体与oriC形成预引发体*DnaG加入形成引发体（oriC引发体），合成引物RNA*引物合成后，DNApol组装到引发的RNA上，完成复制体的组装简单复制过程DnaASSB13bprepeats涉及转录激活一分子的DNApolIII.协同合成前导链和后随链复制终止a、终止序列E.coli有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白序列一：terEterDterA序列二：terFterBterC每个区域只对一个方向的复制叉起作用b.专一性终止蛋白E.coli中由tusgene编码通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用ter4、DNA损伤与修复•光复活•切除修复•重组修复•SOS修复phR471aa（一）photoreactivation（光复活）----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----可见光激活•可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体•是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体（二）切除修复（excisionrepair）•即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常，这是一种比较普遍的修复机制•细胞的修复功能对于保护遗传物质DNA不受破坏有重要意义（三）重组修复（recombinationrepair）•又称复制后修复（postreplicationrepair）•受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复，并非完全校正（四）、SOS修复•允许子链DNA复制合成时越过亲链上受损伤的片段而不形成缺口•旁路系统•是DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-ProneRepair）三、原核和真核生物基因结构的特征•原核基因：1、功能相关的基因大多是以操纵子结构出现；2、蛋白质基因通常以单拷贝的形式存在；3、编码RNA的基因通常是多拷贝的；4、位于DNA上的各种调控元件的DNA顺序是多种多样的，为基因表达调控的多样性和精确性提供了结构基础。•真核基因：1、复杂的染色体结构：着丝点、端粒，与DNA复制起点一起构成染色体不可缺少的三要素2、DNA重复顺序重复序列的存在是真核生物DNA区别于原核生物DNA的一个重要特征3、基因的不连续性（外显子、内含子）４、真核生物基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因组成为单一的基因簇或基因家族（geneFamily）Alu序列家族5、存在串联重复基因四、RNA的转录和RNA的加工发生在细胞核中，以DNA分子为模板，按照碱基互补的原则，合成一条单链的RNA即mRNA，DNA分子携带的遗传信息被转移到RNA分子中。其过程与DNA的复制基本相同1、RNA转录•转录的起始•转录的延伸•转录的终止RNA聚合酶（RNA-pol）1、不需要引物，能发动新链，也能延长多核苷酸链2、合成方向5‘→3’，按碱基配对原则（A-U,C-G）3、要求有完整的DNA双链或单链为模板4、需要4种三磷酸核苷酸----ATP,GTP,UTP及CTP为反应底物5、能识别DNA链上起始点特点：转录的起始大肠杆菌RNA聚合酶------a2bb′sa2bb+s=a2bb′s核心酶+s=全酶分子量功能a36512决定转录的基因b150618催化转录b′155613结合DNA模板(开链)s70263辨认起始点真核生物的RNA聚合酶RNA聚合酶ⅠⅡⅢ别名rRNA聚合酶不均一RNA聚合酶小分子RNA聚合酶定位核仁核质核质转录产物tRNAmRNAtRNA.5srRNAα-鹅膏蕈碱的影响不敏感高度敏感中度敏感σ因子辨认起始点RNA聚合酶全酶结合到起始点打开双链RNA链合成开始σ因子脱落，RNA链延长转录的起始1）、与转录调控有关的DNA序列•－10区pribnow框（TATAAT）：RNA聚合酶的牢固结合位点•－35区Sextama框（TTGACA）：RNA聚合酶的识别位点•一般来说，对于给定的启动子，其特异性序列趋于启动子共有序列时－10与－35区之间的间距趋于17bp时，启动子的转录效率可能就高•天然启动子中这段距离多为15－20bp编码链AACTGTATATTA模板链TTGACATATAAT3’5’DNA转录起始点Pribnow盒子启动子3510+1转录区5’3’RNA转录起点与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基●原核生物启动子结构典型启动子的结构-35-10转录起点16-19bpTTGACATATAAT5-9bp•真核生物的启动子：①帽子位点及转录的起始位点，其碱基大多是A②TATA框：处转录起始点上游－30区到－25区段，框内任何碱基的替代突变都使转录活性降低，是绝大多数真核基因正确表达所必需的③在起始位点的上游－50、－75、－100左右都存在与基因转录起始有关的序列：－75区附近的CAAT框可能控制着转录起始的频率④增强子⑤负控制序列真核生物启动子的结构核心启动子（corepromoter）上游启动子元件（upstreampromoterelement，UPE）上游启动子元件●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等●作用：控制转录起始频率CAAT：-70--80bpGGGCGG：-80--110bp转录的延伸•在转录泡上进行53DNA原核生物转录过程中的羽毛状现象核糖体RNARNA聚合酶•出现延宕∞减少DNA序列中的G·C碱基对的含量∞RNA聚合酶没有校对能力，转录过程没有校对机制∞转录的精确性必须依靠RNA聚合酶在选取互补核苷酸或拒绝非互补核苷酸的立体化学特性真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。转录的终止RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来，就是转录终止。•强终止子－内部终止子•弱终止子－需要ρ因子（rhofactor）又称为ρ依赖性终止子（Rho-dependentterminator）不依赖Rho(ρ)因子的转录终止依赖Rho(ρ)因子的转录终止ATPA.依赖Rho因子的转录终止因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录RNA聚合酶ρ因子附在RNA链上ρ因子RNA链形成一个发夹结构，转录停止，ρ因子利用ATP能滑行ρ因子发挥解螺旋酶活性，解开发夹和RNA-DNA依赖Rho因子的转录终止B.非依赖Rho因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度效率茎环结构使转录终止的机理•使RNA聚合酶变构，转录停顿•使转录复合物趋于解离，RNA产物释放5´pppG5335RNA-pol•原核生物和真核生物初级转录产物都需经一定程度的加工才具有活性。•原核生物RNA加工、真核生物RNA加工2、RNA加工原核生物中rRNA前体的加工甲基化作用专一核酸外切酶30S前体17StRNA25S专一核酸外切酶16SrRNAtRNA23SrRNA5SrRNA专一核酸外切酶tRNA前体分子的加工a、切除tRNA前体两端多余的序列：5’—端切除几到10个核苷酸。b、末端添加：3’-端添加CCA序列。c、修饰：形成稀有碱基如DH2。RNAasePRNAaseFRNAasePRNAaseFRNAaseDRNAaseDACC表示核酸内切酶的作用表示核苷酸转移酶的作用表示核酸外切酶的作用表示异构化酶的作用帽子结构：7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）5pppGp…5GpppGp…pppGppi鸟苷酸转移酶5m7GpppGp…甲基转移酶SAM帽子结构的生成5ppGp…磷酸酶Pim7Gppp鸟甘酸转移酶帽子结构功能：•①能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合；•②m7Gppp结构能有效地封闭mRNA5’末端，以保护mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。I协助成熟的mRNA从细胞核向细胞质转运；ii.提高mRNA在细胞质中的稳定性；iii.作为核糖体的识别信号，使mRNA得以有效翻译；加尾3、RNA剪接剪接：剪接体与处于内含子5ˊ端的5ˊ剪接位点和3ˊ端的3ˊ剪接位点相互作用而完成。剪接体：一类复杂的核糖核蛋白颗粒，由核小RNA（smallnuclearRNAs,snRNA）和各种蛋白质组成。snRNA:分子内富含尿嘧啶核苷酸，称为U1、U2、U4、U5、U6。snRNP:snRNA与特定的蛋白质结合，组成特定的核小RNA蛋白体。完整的剪接体就是通过UsnRNP之间RNA同蛋白质、RNA同RNA以及蛋白质与蛋白质相互作用组装而成。外显子内含子DNAmRNA转录形成套索RNA，外显子靠近剪接体去除套索RNA，外显子连接成熟mRNAmRNA的剪接靠近UpAGpU5'3'5'外显子3'外显子内含子pG-OHpGpAGpU3'U5'OH第一次转酯反应第二次转酯反应U5'pU3'pGpAGOH5'3'连接4、RNA的编辑•编辑（editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。ApoB基因有29个外显子CAA第2153个密码子编码Glu编辑CAAUAA翻译翻译在肝中剪接后的mRNA肠中的mRNA经编辑编码了4563aa的载脂蛋白产生了终止密码子，在2153aa处终止合成图13-4