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分子生物学实验室实验一氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验二细菌质粒DNA的提取实验三琼脂糖凝胶电泳实验四细菌基因组DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳实验五质粒DNA限制性内切酶实验实验六聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因实验七胶回收法纯化DNA与琼脂糖凝胶电泳南京工业大学制药与生命科学学院生物工程与技术基础实验与工程实训中心《分子生物学实验》教学大纲英文名称：Molecularbiology学分：1学时：32教学对象：生物工程专业、制药工程专业、药剂学专业、食品学专业、生物技术专业教学目的：在开设的理论课程的基础上，结合实验课程的教学，使学生能较全面系统的掌握分子生物学的基本操作，拓宽专业知识面，加深对专业知识的理解，强化动手能力。。基本要求：了解分子生物学的实验操作原理，掌握有关实验仪器的使用方法。实验内容：实验一.细菌质粒DNA的提取及酶切实验（8学时）基本要求:通过学习碱变性抽提法对大肠杆菌中的质粒的抽提，掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。进一步了解限制性内切酶的特性及酶切反应过程，掌握DNA的酶切技术。重点:掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。进一步了解限制性内切酶的特性，掌握DNA的酶切技术。难点:掌握质粒DNA的小量制备方法及DNA的酶切技术。实验二.细菌基因组DNA的提取（4学时）基本要求:了解细菌基因组DNA的提取的目的，原理，掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法重点:掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法难点:掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法实验三.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验（4学时）基本要求:了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理及转化反应的目的，应用范围及操作过程，掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。重点:掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的操作技术难点:大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验四.聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因及琼脂糖凝胶电泳（8学时）基本要求:熟悉聚合酶链反应（PCR）的基本原理、实验基本条件；了解PCR反应条件的优化和注意事项和应用范围掌握聚合酶链反应（PCR）的实验技术：了解核酸琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤，掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。重点:掌握掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。难点:聚合酶链反应（PCR）的实验技术，琼脂糖凝胶电泳的实验方法。实验五.聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质（4学时）基本要求:了解聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质的基本原理，学会用该法测定蛋白质分子量的操作技术。重点:掌握聚丙烯酰氨凝胶的配制方法，了解聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质的基本步骤及实验结果的判定难点:聚丙烯酰氨凝胶电泳的实验步骤及实验结果的判定实验一氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验目的掌握重组DNA质粒转化至大肠杆菌宿主的操作技术。实验原理带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA的载体分子通过。实验步骤1感受态细胞的制备：1)挑菌37℃培养。2)将过夜培养的细菌转接培养2-3小时。3)将菌液置冰上10分钟，4℃离心8000rpm30秒。4)用氯化钙溶液悬浮菌体，冰浴，离心弃去上清。5)氯化钙溶液悬浮菌体。2转化：1)取出感受态细胞,试剂A，无菌双蒸水和待转化的质粒DNA，均置冰盒内。2)取离心管管一支，将质粒、试剂A、无菌水，感受态细胞混匀冰浴20分钟。3)在管内加入400ulLB液体培养基，振荡培养10-40分钟。4)涂布培养。大肠杆菌形态图实验二质粒DNA的提取实验目的本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒pET-22b的抽提，掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的基本原理。实验原理载体是基因工程所必需的工具，它用于将目的基因运载到宿主细胞内进行克隆与表达。常用的载体有质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、逆转录病毒DNA和昆虫病毒DNA等，而质粒是最常用的载体。实验步骤1收集菌泥。2悬浮细菌。3加入200μl裂解液(Solution2)，充分裂解菌体。4加入400μl絮凝剂(Solution3)。515000rpm离心10分钟，无需低温离心。6将步骤5中的上清转移到吸附柱(3S)中，12000rpm离心1分钟。7将吸附柱放入同一支收集管中，吸取洗涤液到吸附柱，离心1分钟。8重复步骤7一次。9将吸附柱放入同一支收集管中，高速离心2分钟。10在吸附柱(3S)膜中央加50μl无菌双蒸水，室温高速离心1分钟。质粒图谱1质粒图谱2质粒电泳图实验三琼脂糖凝胶电泳实验目的用来检测DNA的情况，如DNA片段分子量的大小、纯度等。实验原理利用琼脂糖凝胶电泳相对于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相对分子量。一般800bp以上的片段用08%的琼脂糖凝胶，800bp以下的片段，用10%-20%的琼脂糖凝胶。用溴化乙锭染色，在紫外灯下可以直接确定并分析DNA片段在凝胶板中的迁移率。实验步骤：1将配好的电泳缓冲液，倒入电泳槽。2将琼脂糖凝胶放入微波炉熔化。3熔化后的琼脂糖凝胶倒入插好梳子的模具中。4静置1小时左右，等琼脂糖凝胶凝固后垂直拔去梳子。5将琼脂糖凝胶放入电泳槽中。6点样,一般上样量为10×LoadingBuffer05-1μl、DNA样品（质粒）3μl混匀，点入凝胶孔内。7质粒电泳参数：电泳仪的电压100V，电流500mA，功率250W。电泳时间40分钟。8将琼脂糖凝胶取出，放入紫外与可见分析装置。9凝胶成像系统显像，拍照。电泳图凝胶成像系统实验四细菌基因组DNA的提取实验目的本实验通过利用小量细菌基因组DNA抽提试剂盒对大肠杆菌基因组DNA的抽提，掌握细菌基因组DNA的小量制备方法。实验原理本实验使用溶菌酶破壁及蛋白酶K消化以确保基因组DNA得率。不使用苯酚/氯仿等有机试剂，无须传统的乙醇沉淀、洗涤、干燥、溶解过程，简化了操作。实验步骤1细菌的消化2加入400ulDL液和25ul蛋白酶K，迅速温和地来回颠倒离心管彻底混匀。温浴30分钟。离心1分钟后，取上清至另外一个离心管中。3加入200ul异丙醇,离心弃去收集管中的液体。4加入500ul洗涤液，离心30秒。5将吸附柱移入另外一个干净的收集管中。离心15秒。6将吸附柱放入同一个收集管中。离心1分钟。7在吸附膜中央加入100ulT1液，离心1分钟。将DNA-20℃保存。8取纯化后基因组片段洗脱液2μl加上样缓冲液1μl混匀，标准分子量DNA2-3μl，电泳检测结果。大肠杆菌的细胞的结构细菌基因组DNA的结构实验五质粒DNA限制性内切酶实验实验目的通过DNA限制性内切酶实验掌握内切酶技术。实验原理不同酶切反应都需要不同的酶切缓冲液。多数生物技术公司的产品目录中均有关于何种限制性内切酶适合何种缓冲液的资料可供查阅。绝大多数酶的反应温度是在37℃。酶切反应时间有30分钟、60分钟，以至2小时以上甚至过夜。本次实验要进行的是对重组质粒pET-22b进行EcoRI酶切，重组质粒上有两个EcoRI识别位点。实验步骤1在离心管管中以编号次序加入以下相应试剂：（1）ddH2045μl（2）10×Buffer2μl（3）BSA小牛血清25μl（4）质粒DNA10μl（5）EcoRⅠ1μl总体积20μl237℃水浴15小时后，终止酶切反应。3取单酶切反应液10μl和上样缓冲液2μl，混匀，标准分子量DNA5μl，待作电泳上样液。408%的琼脂糖凝胶电泳。5紫外灯下观察酶切琼脂糖凝胶电泳图。琼脂糖凝胶电泳图内切酶酶切DNA示意图内切酶酶切DNA立体示意图实验六重组DNA的PCR扩增实验目的学习PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理多聚酶链式反应的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两测和与其两测互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸后，DNA可扩增一倍。实验步骤1在02ml离心管管内配制50μL反应体系：（1）ddH2O38μL（2）10×buffer5μL（3）dNTP1μL（4）Taq酶1μL（5）引物P11μL（6）引物21μL（7）模板DNA3μL2按下列程序进行扩增：（1）94℃预变性5分钟；（2）94℃变性50秒；（3）55℃退火50秒；（4）72℃延伸10秒；（5）重复步骤②-④30次；（6）72℃彻底延伸10分钟。3琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。PCR反应的原理琼脂糖凝胶电泳图实验七胶回收法纯化DNA实验目的本实验利用胶回收纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中将目的DNA片段进行抽提纯化，从中掌握切胶技术以及回收目的DNA片段并纯化的方法。实验原理琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。胶回收是指目的DNA片段经由琼脂糖凝胶电泳与其它片段分离，再从琼脂糖凝胶中将目的DNA片段抽提纯化出来的过程。实验步骤操作流程见右图1目的DNA电泳。2切出含有目的DNA的凝胶。3称量胶块重量，计算胶块体积。4向胶块中加入胶块融化液。575℃加热融化胶块。6将溶液转移至SpinColumn中离心1分钟，弃滤液。7用RinseA，RinseB冲洗SpinColumn。8在SpinColumn膜的中央处加入25μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。9取胶回收目的基因片段洗脱液1μl加上10×LoadingBuffer1μl混匀。净备净备0粉司燥备斯斯斯斯斯培B疗培B疗动器0疗验验验验像技锅8子锅8子锅8子清声浴器浴器浴器浴器泳器泳器泳泳荡设学器荡设荡设学学学器器器器器仪器编号仪器名称型号单价厂家购置日期领用人存放地点20056176标准型双人SW-CJ-IC3490苏州净化设2005.10刘洋笃行40720056177标准型双人SW-CJ-IC3490苏州净化设2005.10刘洋笃行40720056127冰箱海尔BCD-212320青岛海尔2005.12刘洋笃行40720056023超声波细胞JY92-II2D11488宁波新芝公2005.12刘洋笃行40720010674电热鼓风干101C-33490苏州净化设2005.12刘洋笃行40720051742电子天平BS224S6900北京赛多利2005.13刘洋笃行40720051743电子天平BS224S6900北京赛多利2005.14刘洋笃行40720056016电子天平BS224S6900北京赛多利2005.15刘洋笃行40720056144电子天平BS224S6900北京赛多利2005.12刘洋笃行40720056146电子天平BS224S6900北京赛多利2005.12刘洋笃行40720051786隔水式恒温PYX-DHS5002950上海跃进医2005.03曹飞笃行40720051787隔水式恒温PYX-DHS5002950上海跃进医2005.03曹飞笃行40784070001精密增力电JJ-1510常州国华电2005.10刘洋笃行40720051747冷藏柜海尔SC-3291900青岛海尔2005.12刘洋笃行40720051750冷藏柜海尔SC-3291900青岛海尔2005.12刘洋笃行40720054981酶标仪BTO-Rad6843000南京惠众医2005.12周华笃行40720056017三温水浴锅DK-8D1460上海精宏实2005.12刘洋笃行40720056018三温水浴锅DK-8D1460上海精宏实2005.12刘洋笃行40720056019三温水浴锅DK-8D1460上海精宏实2005.12刘洋笃行40720056093三温水浴锅DK-8D1565上海精宏实2005.12刘洋笃行40720054980生物电泳图FR-98038000上海复日科2005.12周华笃行40720056031手提式灭