分子生物学实验指导

分子生物学实验指导动植物检疫专业2012，22分子生物学实验注意事项1．课前要提前预习实验内容，了解实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。2．由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。3．实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在理论课上课期间完成。4．实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！5．对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。6．写作实验报告或实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻。7．在实验室内不能大声喧哗。8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地丢弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。9．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。3实验一质粒DNA的提取1．目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。2．原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。4．试剂pMD18-T-F载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbuffer（pH8.0）。5．实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200L5NNaOH调pH至7.0，加ddwater至1L，121C20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0）；溶液II（0.2mol/LNaOH，1%SDS）；溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补ddwater至100ml），70%乙醇（-20C保存），TEbuffer（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0）；10mg/mLRNaseA（RNA酶A溶于10mmol/LTrisHClpH7.5，15mmol/LNaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121C30min）。6．操作步骤（1）在超净工作台中取5mlLB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。（2）从超低温冰箱中取出保存pMD-18T-F的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），4留沉淀备用。（4）在沉淀中加入100l溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）（5）加入200l溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（6）加入150l溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（7）15000rpm离心5min，小心吸取400l上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800l95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（8）15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，加入500l70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（9）再加入500l70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（10）离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。（11）pMD18-T-F加入30l无菌蒸馏水或TE缓冲液，用记号笔标记后放入冰箱中备用。（12）在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告7．思考（1）影响本实验结果的因素有哪些？5实验二、质粒DNA的酶切1．目的学会用限制性内切酶切割质粒DNA。2．原理II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。4．试剂pMD18-T-F质粒，EcoRI，BamHI，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲液5．实验准备配制TAE电泳缓冲液（50储存液），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）6．操作步骤（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中：pMD18-T-FDNA(或pUCm-T-F)6μL10×酶切缓冲液（用EcoRI的缓冲液）2μLddwater30μLEcoRI1μLBamHI1μL总体积40μL（2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1μL限制性内切酶。（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1-3h（一般是37℃）。（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。6（6）酶切后的质粒可以回收备用。（7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。7．思考（1）酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？（2）如何估计DNA用量和酶的用量？（3）在吸取内切酶的时候如何操作才能别免浪费？7实验三、质粒DNA的PCR扩增1．目的学会PCR操作的基本技术。2．原理是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。4．试剂3U/μlTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2free），25mMMgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-F，无菌ddwater。5．实验准备dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。合成的引物：Senseprimer5'-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3'Antisenseprimer5'-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3'目的基因模板质粒：已经克隆在pMD18-T-F载体上的781bpNDV-F基因。待扩增的F片段长度：837bp。6．操作步骤（1）在0.2mlPCR微量离心管中配制50μl反应体系。ddwater32μl10×PCRbuffer（不含MgCl2）5μl25mMMgCl23μl2.5mmol/LdNTP4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）10μmol/LPrimer12μl（12.5—25pmoles）10μmol/Lprimer22μl（12.5—25pmoles）模板质粒1μl（1×10-3pmoles）83U/μlTaq酶1μl（3u）总体积50μl（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：①94℃5min②94℃1min③60℃1min④72℃1min50s⑤goto②29times⑥72℃10min（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。（4）清理桌面，撰写实验报告。7．思考（1）复性温度如何确定？（2）为什么要在最后延伸10min？（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？9实验四、DNA电泳鉴定1．目的学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。2．原理DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3．器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。4．试剂pMD18-T-F载体，TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液（或6加样缓冲液），DNA分子量标准（DNAHindIII:23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130bp）。5．实验准备配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：Tris碱242g，57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，ddwater定容至1L），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mLddwater，4C避光储存），10加样缓冲液（20%Ficoll400，0.1mol/LNa2EDTApH8.0，1.0%SDS，0.25%溴酚蓝）；6加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。6．操作步骤（1）称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50mlTAE电泳缓冲液(1)，放入微波炉中烧开（1min）。50ml正好倒两块小胶。（2）注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。（3）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60C）。（4）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。（5）在水平电泳槽中加满1TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。10（6）待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝