分子生物学概述

医学分子生物学基础（MedicalMolecularBiology）基础兽医系动物生化教研室苗晋锋博士第一讲医学分子生物学概述ＤＮＡ分子的力度美主要内容¾课程简介与要求¾分子生物学定义¾本课程研究内容¾发展简史课程简介与要求†课程类型：选修¾学分：2.5¾学时：45（理论27实验18）†实验课地点：逸夫楼2003时间：自选†考核方式：闭卷PPT制作（2张幻灯片，内容自选，考试前上交）分子生物学常用参考书目†医学分子生物学（杨吉成，陈子兴）†MolecularBiologyoftheCell(5thEditionbyBAlberts)†MolecularCellBiology(4thEditionbyHLodish)†MolecularBiology(2ndEditionbyRWeaver)†MolecularBiology(InstantNotesinMolecularBiology,2ndEditionbyPTurner）†AdvancedMolecularBiology(byRTwyman)†现代分子生物学（朱玉贤等）常用分子生物学论坛、网站¾¾¾¾¾分子生物学定义广义:研究蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能，也就是从分子水平阐明生命现象和生物学规律。狭义:偏重于核酸(或基因)的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程，也涉及这些过程中有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。分子生物学是对生物在分子层次上的研究。这是一门生物学和化学之间跨学科的研究，其研究领域涵盖了遗传学、生物化学和生物物理学等学科。分子生物学主要致力于对细胞中不同系统之间相互作用的理解，包括DNA，RNA和蛋白质生物合成之间的关系以及了解它们之间的相互作用是如何被调控的。（维基百科）现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点——在生命有机体中，基因是唯一能够复制，并且能永远存在的单位，而其意义最终须通过蛋白质才体现出来。从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。中心法则¾分子生物学是生命科学中发展最快并且与其他学科广泛交叉和渗透的前沿领域。¾分子生物学的发展推动了细胞生物学、遗传学、发育生物学和神经生物学向分子水平的方向发展，使这些学科已不再是原来的经典学科，而成为生命科学的前沿。本课程讲授内容¾基因与基因组¾DNA、RNA、蛋白质¾基因表达调控¾分子克隆常用的工具酶和载体¾基因克隆¾核酸分子杂交及其应用¾聚合酶链反应（PCR）¾基因突变¾恶性肿瘤的分子生物学¾基因诊断及基因治疗¾转基因动物分子生物学发展简史†四大里程碑¾1944年，Avery等报道了肺炎双球菌转化实验，证明生物的遗传物质是DNA；¾1953年，Watson和Crick阐明了DNA双螺旋结构；¾遗传密码的破译；¾基因转移载体的发现DNA是遗传物质1944年，Avery发现DNA是遗传物质最初的双螺旋模型1952,FranklinDNAX-射线衍射图(51号照片)1953年DNA双螺旋结构模型的建立，标志着生物化学发展进入分子生物学时期。Waston,Crick,Wilkins三人共获1962年诺贝尔生理学或医学奖。Itwasinthispub,EaglepubinCambridge,JamesWatsonandFrancisCrickannouncedtheirdiscoveryofDNAonFebruary28,1953.1952年,Franklin的DNAX射线图片DNA有典型的螺旋结构,并且由2条以上多核苷酸链组成•DNA双螺旋结构富含哲理，体现着一种科学之美。•DNA是螺旋状的，体现了生命科学的上升之路也是螺旋的。•DNA可以自我修复，体现了一种严谨的科学态度。•DNA是互补的双链，体现了一种协作精神。大千世界、人体自身、DNA都还有数不清的未解之谜，正等待着同学们去进行探索。真诚希望同学们可以续写这永无止境的螺旋之美。196８年，Nirenberg以及Crick等几组科学家的共同努力，破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码，证明DNA分子中的遗传信息是以三联密码的形式贮存。20世纪80年代质粒的发现¾质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主细胞染色体外而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。¾绝大多数质粒是DNA型的，天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。基因克隆的载体质粒DNA分子都具有复制子、选择性标记、克隆位点。非融合型pKK223-3结构分泌型PINⅢ-ompA1结构融合蛋白表达载体pGEX结构包涵体型pBV220结构三大技术发明¾工具酶的发明¾基因合成与测序¾PCR扩增仪的应用““分子剪刀分子剪刀””的发现者的发现者酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶（ligase）催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5′→3′聚合、3′→5′外切活性，而无5′→3′外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3′末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析T4多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端脱氧核酸转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾，标记3′末端碱性磷酸酶切除5´末端磷酸基，标记5´末端分子克隆常用的工具酶基因合成和测序双脱氧末端终止法:1977年，剑桥大学SangerF等发明。化学裂解法:美国MaxamI和GilbertW发明。1978年体外首次成功地人工合成第一个完整基因PCRPCR仪器的变迁仪器的变迁†三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）†电加热块＋自来水冷却（PE，1988）†电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）†三个加热块＋机械手（Stratagene，1994）†半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）†温度梯度,荧光检测(如Roche的Lightcycler)†风加热†Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况中国的状况†1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）†现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）¾目的基因的获得¾载体和目的基因的重组¾重组DNA导入宿主细胞¾重组DNA的筛选和鉴定¾功能蛋白的表达基因重组技术SchematicillustrationofDNAcloning相关理论的阐明、工具酶和载体的发现推动了分子生物学技术的发展膜杂交技术示意图Southem印迹杂交法(Southernblothybridization)用于DNA的限制性内切酶图谱；限制性内切酶片段长度多态性的鉴定。可以检测缺失、插入和点突变，在疾病研究中有重要的意义。1974年美国学者Jaenisch首次应用显微注射法获得转基因小鼠。转基因动物已应用于基础研究、疾病动物模型、药用蛋白质生产、农业等领域。1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。她的乳汁可分泌α-抗胰蛋白酶，含量高达30毫克/升。2002年2月12日,历时10载耗资30亿美元的人类基因组计划最终完成,并报道了99%的人类基因组序列.世纪初基本完成的这项工作堪与阿姆斯特朗和奥尔德林乘坐阿波罗11号宇宙飞船登月相媲美.从这时起,生物学被重新划分为前基因组和后基因组两部分,我们正生活在后基因组时代.人类基因组草图公布于Nature和Science杂志精神病基因的发现†研究人员确认了增加患上由家族遗传的精神分裂、抑郁症和其他精神疾病的基因。发现了一组增加患上抑郁症机会的基因，但患者在受到严重压力下才会触发基因活动。†这一成果位列2003年重大科技突破第二位垃圾DNA†人体内非编码ＤＮＡ虽然占人体基因组的９５％，但它却不像编码基因那样控制产生特定的蛋白质，所以曾经被称为“垃圾DNA”。英国科学家最近研究发现，这些貌似无用的ＤＮＡ对某些疾病的严重程度却有着很大影响。†这些DNA对于基因在正确的位置和正确的时间“开启”起到关键的帮助†这一成果位列04年重大科技突破第五位干细胞（stemcell）是一类既有自我更新能力，又有多分化潜能的细胞。干细胞的研究一方面可以揭示许多有关细胞生长和发育的基础理论难题；另一方面可望将其用于创伤修复，神经再生和抗衰老等临床医学研究。RNA曾被认为是一种缺乏活力的生物分子，但最近一系列发现表明，一种称作小RNA的RNA分子参与着多项细胞控制工作，能够关闭基因或改变它们的表达水平。这一现象称为核糖核酸介入（RNAi），它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。小RNA的这种功能有可能使21世纪的医药研究产生革命性的变化。P53被“Science”评为年度分子明星p53基因是一种肿瘤抑制基因，定位于人类17号染色体短臂，编码p53磷蛋白；p53磷蛋白的正常功能是调控细胞增殖，在白血病、骨肉瘤、肺癌和结直肠癌中有p53蛋白的突变和缺失。大量实验表明，人体内约50%的肿瘤发生与P53的缺失，突变有关，也与P53蛋白与病毒蛋白的结合，导致P53蛋白失活有关。03年10月央视国际报道了我国用于恶性肿瘤治疗的基因药物诞生并批准上市。这种由深圳赛百诺基因技术有限公司研制的基因药物名为重组腺病毒P53抗癌注射液，主要用于治疗头颈部鳞癌和其他恶性肿瘤。分子生物学的未知领域¾地球上的生命是怎样起源的？¾地球以外的天体上有没有生命？¾癌的问题、人体自身免疫问题、大脑的记忆、推理的分子生物学、生物行为有什么规律？¾遗传物质是怎样进化的？¾受精卵中的遗传物质怎样发生成个体？†还原型谷胱甘肽分子中的肽键有何特点?还原型与氧化型谷胱甘肽的结构有何不同?†什么是酶原激活?它有何生物学意义?†分别写出己酰CoAβ-氧化与三羧酸循环中,以FAD和NAD+为辅酶的脱氢酶的名称。†请论述柠檬酸调控软脂酸生物合成的机理。†在研究蛋白质多肽链生物合成时发现,当编码某氨基酸的一个密码子变成终止密码子或变成编码另一种氨基酸的密码子时,所合成的蛋白质有的生物活性不变,有的生物活性会发生改变.请分析产生上述现象的生化机制。分离纯化某蛋白酶的主要步骤和结果如下表:分离步骤分离液体积/mL总蛋白含量/mg总活力单位/IU1离心分离1400100001000002硫酸铵盐析和透析2803000960003离子交换层析90400800004亲和层析6345000(1)根据上述结构,计算第2至4步骤中,每步的比活力和纯化倍数.(2)亲和层析的原理是什么?†1)还原型谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸残基构成，其中一个肽键是由谷氨酸的γ羧基和半胱氨酸的α氨基之间脱水缩合形成，而另一个肽键是由半胱氨酸的α羧基和甘氨酸的α氨基之间脱水形成。（4分）†2）还原型谷胱甘肽还有3个氨基酸残疾和1个游离的疏基，氧化型谷胱甘肽含有6个氨基酸残基和一个二硫键。（4分）†1）酶原激活是指无活性的前体转变成有活性的酶的过程(3分)†2）酶原激活是生物体的一种调控机制。在细胞中某些酶以酶原的形式合成和贮存，这种方式一方面可以保护合成这些酶的细胞免受损伤；另一方面在机体需要这些酶时，酶原可被迅速分泌并激活，参与消化、血液凝固和生长发育等生理过程。（5分）†1）己酰CoA的β-氧化中以FAD为辅酶的脱氢酶有：己酰CoA脱氢酶、丁酰CoA脱氢酶；以NAD+为辅酶的脱氢酶有：β-羟己酰CoA脱氢酶、β-羟丁酰CoA脱氢酶。（4分）