分子生物学研究技术(理论)

分子生物学研究技术朱国辉[e-mail]一般认为1973年是基因工程诞生的元年。上世纪40年代——70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作。第一节基因工程的诞生1944年，AveryO.T.利用肺炎双球菌转化实验1、DNA是遗传物质被证实理论上的三大发现40年代，证实DNA是遗传物质早在上世纪20年代，已经知道染色体由DNA和组蛋白构成，但组成蛋白的氨基酸有20种，而组成DNA的核苷酸只有4种，什么是遗传物质？1928年，英国微生物学家F.Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。（1）S型：注射小白鼠，死亡。（2）S型，65℃加热：注射小白鼠，活。（3）R型：注射小白鼠，活。（4）65℃加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。40年代，DNA是遗传物质被证实1944年，美国洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。（1）S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌；（2）经DNase处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。（3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。Watson和Crick2、DNA双螺旋模型的提出50年代，DNA的双螺旋模型的提出和DNA复制机理的阐明DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。1953年，FrancisCrick和JamesWatson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随后，DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。Nireberg等为代表的一批科学家3、“中心法则”的提出60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则）既然，DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，Boyer等相继发现了ＥcoRI一类重要的限制性内切酶。1、限制性核酸内切酶的发现和应用技术上的三大发明1967年，世界上又五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。2、DNA连接酶的发现和应用1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组；3、载体的发现及其应用1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。这一年被定为基因工程诞生的元年。3、载体的发现及其应用Cohen等的重组实验示意图TcrNerEcoRIEcoRI连接酶TcrNer双抗重组菌落基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化基因工程研究的基本步骤1、从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段）2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到重组DNA分子。3、将重组DNA分子导入受体细胞中，并进行繁殖。4、选择得到含有重组DNA分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使得目的基因得到扩增。5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等。基因工程的基本流程基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞第二章基因操作的工具酶第一节限制性核酸内切酶及其应用第二节DNA连接酶及其应用第三节DNA聚合酶及其应用Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、限制性核酸内切酶的分类合命名2、II型限制性核酸内切酶的基本特性3、限制性核酸内切酶的消化反应第一节限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300中微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶的分类1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型单一多功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点1000bp不是无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+特异性位点及其附近是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3’端24-26bp处是有用限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichiacoli表示为Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示为Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如EcoRI、HindIII。II型限制性核酸内切酶的3大特点1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、5、6或7个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端cohesiveends因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。平末端Bluntend因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，50L反应体系中完全降解1gDNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：A.DNA的纯度和甲基化程度B.甘油的含量（不超过5%）C.反应体系中的离子强度D.反应体系的pH值F.反应的温度条件（通常为37℃）酶单位的定义和影响酶活性的因素Buffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMBuffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT1、DNA连接酶作用的特点2、DNA连接酶的反应条件第二节DNA连接酶及其应用DNA连接酶作用的特点A.连接的两条链必须分别具有3′端自由羟基（-OH）和5′端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。OKNODNA连接反应的条件连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在4-16℃连接。影响连接效率的因素有：A.温度（最主要的因素）B.ATP的浓度(10M-1M)C.连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）D.反应时间（通常连接过夜）E.插入片段和载体片段的摩尔比转化4℃过夜加反应液CK-重组菌落CK+粘性末端DNA片段的连接NickNick1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段第三节DNA聚合酶及其应用大肠杆菌DNA聚合酶I（E。ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先从大肠杆菌E。Coli细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力：A.5′-3′聚合酶活性以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3′末端，并不断延伸。B.5′-3′外切酶活性将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。C.3′-5′外切酶活性将游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段第三节DNA聚合酶及其应用Klenow片段的主要用途Klenow片段大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。Klenow片段的主要用途A.修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端B.标记DNA片段的末端C.cDNA克隆中第二链cDNA的合成D.DNA序列的测定GAACTTAA第三章基因克隆的载体引言（introduction）第一节质粒载体（plasimidvectors）第二节噬菌体载体（phagevectors）第三节柯斯质粒载体（cosmidvectors）第四节人工染色体载体（B/Y/HAC）引言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：A.能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；B.具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；C.具备多克隆位点（MCS），而且可携带外源DNA片段的长度范围较宽。D.自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和DNA的制备。CharacteristicsofvectorsforgenecloningMCSMarkerForeigngene第三章基因克隆的载体引言（introduction）第一节质粒载体（plasimidvectors）第二节噬菌体载体（phagevectors）第三节柯斯质粒载体（cosmidvectors）第四节人工染色体载体（B/Y/HAC）第一节质粒载体（plasimidvectors）1、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍1.质粒载体的生物学特性（1）质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。1.质粒载体的生物学特性（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。1.质粒载体的生物学特性（4）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigentplas