分子生物学研究方法-PCR

分子生物学研究方法PCR技术在医学中的应用•一.多聚酶链反应(PolymeraseChainReaciton,PCR)•（一）原理热变性（94度）引物退火（55度）延伸（72度）DNA聚合酶dNTP变性退火引物经25~30次循环，目的DNA增加166-7（二）。PCR反应的主要成分和作用•1。DNA聚合酶：PCR反应使用的是耐热DNA聚合酶。•比如：TaqDNA聚合酶。•可分为两大类：（1）具有校正功能的（有3‘5’核酸酶活性）比如：Vent,pfu,pwo等（2）不具有校正功能的（无3‘5’核酸酶活性）比如：一般的TaqDNA聚合酶2。引物（1）引物长度以15~30个bp为宜。引物过短会使特异性降低，过长时则成本增加，且也会降低特异性。（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45~55%左右。（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3‘末端不应有互补链存在。（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时进行辅助检索分析。（5）引物3‘末端碱基：原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。另外引物3‘末端的末位碱基在很大程度上影响着TaqDNA聚合酶的延伸效率。研究表明，引物3‘末端碱基在错误配对时，不同碱基的引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成。而末位碱基为T时，错配时引发效率大大降低。G,C居于中间，所以3‘末端的末位碱基最好选T,G,C而不选A.(6)引物5‘末端碱基：PCR反应物5’末端碱基并没有严格限制，只要与模板DNA结合的引物程度足够，其5‘末端碱基可以不与模板DNA匹配，而呈游离状态。这样引物设计时可以在5‘末端加上限制性内切酶位点或其他短的序列。可以加ATG起始密码，可以加错配碱基造成突变。3。PCR反应缓冲液：组成50mMKCl10mMTris.Cl(pH8.4)1.5mMMgCl2Mg++是Taq酶活性所必需的金属离子。Mg++浓度的高低能影响反应的特异性和扩增片断的产率。1.5~2.0mMMg++是比较合适的。Mg++过量能增加非特异性扩增并影响产率。4。底物dNTP浓度在PCR反应中，dNTP浓度应在20~200uM,dNTP浓度过高可加快反应速度。同时，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。此外，由于dNTP可能与Mg++结合，因此应注意Mg++浓度和dNTP浓度之间的关系。（三）．怎样提高PCR的特异性•1．热启动（hot-start)•比如（1）将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开•（2）利用Taq酶的单克隆抗体抑制其活性。•2.Touchdown•先在高于退火温度下进行几轮PCR循环，然后再在退火温度下进行大量扩增。•3.NestedPCR•先在要扩增片断的外侧设计一对引物，进行PCR，然后以此PCR产物为模板，再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的片断。二PCR的应用（一）未知DNA片断的克隆1，基因组DNA步移法12345已知DNA序列接头接头PCR•2，InversePCR限制酶切点（X）限制酶切点（X）已知序列限制酶X酶切连接引物2引物1PCR(二）利用PCR对基因功能进行分析和改造(三）基因拼接（四）Invitroevolutionofgene-codingproteinDNAShuffle•基本过程•1．Preparationofgenestobeshuffled•2．FragmentationwithDNaseI•3．ReassemblybythermocyclinginthepresenceofaDNApolymerase•4．AmplificationofreassembledproductsbyaconventionalPCR•怎样提高高保真的重组体•1．在步骤2）使用Mn2+而不是Mg2+•2．在PCR步骤使用高保真的耐热DNA聚合酶PCRRandomMutagenesis•1．提高PCR反应体系中Mn2+的浓度（可到640uM）•2．在保持Mn2+浓度的基础上，升高dGTP浓度可进一步提高突变率怎样获得理想的突变率•每1000bp含2-6个突变碱基是理想的突变率•1．选择缓冲液•2．突变偏向（mutationalbias)•评估方法：1）transition/transversion•Transition：嘌呤突变为嘌呤，嘧啶突变为嘧啶•Transversion:嘌呤突变为嘧啶•2）A或T转变为G或C的程度，或者是反过来•ATGC/GCAT（五）．基因表达及其调控的分析1.RT-PCR方法基本步骤：AAAAmRNA分离mRNA反转录酶和基因特异引物AAAAmRNAcDNA反转录合成cDNAPCR第一轮PCR合成双链cDNAPCR经多轮PCR合成大量产物电泳，鉴定2,Chromatinimmunoprecipitation(ChIP)主要应用:研究转录因子在体内与其顺式作用元件的结合原理：3.DNA甲基化的分析