分子生物学研究策略-基因表达技术（10月25日）

分子生物学研究策略ResearchStrategyonMolecularBiology3、基因分子生物学的基本技术3.1基因的分子杂交技术3.2基因的扩增技术（PCR）3.3基因的突变技术（转座技术）3.4基因的表达技术（表达系统）3.5转基因技术（转基因动物、转基因植物）3.6微阵列分析**基因表达系统1、大肠杆菌表达系统2、芽孢杆菌表达系统3、乳酸菌基因表达系统4、链霉菌基因表达系统5、酵母菌表达系统6、丝状真菌表达系统7、昆虫表达系统8、哺乳动物细胞表达系统9、植物生物反应器1、大肠杆菌表达系统（GeneExpressionsysteminE.coli）1）大肠杆菌表达系统的特点：（1）遗传背景清楚（2）目的基因表达水平高（3）培养周期短（4）抗感染能力强2）大肠杆菌表达系统研究的发展趋势完善现有的表达系统；重组蛋白质的正确折叠；构象形成；蛋白质的分泌；菌体表面表达技术及其应用；重组蛋白质修饰加工。真核基因在不同表达系统的表达表达白细胞介素IL-3(成熟蛋白)大肠杆菌表达系统20-30u地衣芽孢杆菌表达系统250-300u酵母菌表达系统20u哺如动物细胞2u2、芽胞杆菌表达系统（GeneExpressionsysteminBacillus）1）特点枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物，严格生长在有氧条件下。枯草芽孢杆菌遗传学相当先进，很多噬菌体和质粒适合用作克隆载体。芽孢杆菌可大量产生几种商品酶，如-淀粉酶，蛋白酶及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等，发酵技术发达。具有单层细胞膜组成较简单的细胞外壳。易于分离纯化分泌蛋白2）枯草杆菌宿主菌株由于大肠杆菌的CaCl2转化法对枯草芽孢杆菌无效（1）选择可转化的菌株*168菌株及突变体：营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插入（2）选择转化的方法感受态转化：原生质体转化：电转化：甘氨酸添加培养感受态其它方法，如转导、结合转移3）、可作为宿主的其它菌种：嗜碱芽孢杆菌Bacillusabcalophilus蛋白酶淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefacilus-淀粉酶短芽孢杆菌Bacillusbrevis地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis淀粉酶，抗真菌肽巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium淀粉酶短小芽孢杆菌Bacilluspumilus蛋白酶球形芽孢杆菌Bacillussphaericus灭蚊毒素蛋白嗜热芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus高温-淀粉酶苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis杀虫晶体蛋白耐碱的芽孢杆菌Bacillusalcalophilic碱性蛋白酶炭疽芽孢杆菌Bacillusanthracis4）枯草芽胞杆菌表达系统研究的发展趋势1、表达真核基因蛋白酶水解——缺陷型、抑制剂2、表达商业用酶克隆基因的整合3、表达杀虫晶体蛋白提高杀虫毒力，减少杀虫时间，增加广谱4、利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加强在医药领域多个方面的应用3、乳酸菌基因表达系统（GeneExpressionsysteminLacticAcidBacteria）1）特点：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。大多数不运动，少数以周毛运动。菌体常排列成链。在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵，而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO２等物质的称为异型乳酸发酵。有微好氧菌和专性厌氧菌。LacticAcidBacteriaGenera:–Streptococcus–Leuconostoc–Pediococcus–Lactobacillus–Enterococcus–LactococcusAlltheabovegeneragrowinchains.Manyareusedforthefoodindustry.2）理想乳酸菌表达载体的特征：1、稳定的遗传、传代能力（复制子）2、具有显性的转化筛选标记（Emr）3、启动子的转录是可以调控4、具有多克隆酶切位点3）研究进展（1）食品发酵方面的应用（2）乳酸菌菌种鉴定REA（RestrictionEndonucleaseAnalysis）16SrRNA（PCR）SDS-PAGE（3）抗微生物和食品腐败（4）细胞表面层和外多糖利用生物异构化方法从亚油酸生产具有生理活性的共轭亚油酸（CLA）异构体单体。筛选到一株产生9顺,11反共轭亚油酸的乳杆菌L1，建立了亚油酸制备技术，CLA小试发酵工艺，共轭亚油酸的HPLC纯化分离和毛细管电泳鉴定技术。（5）蛋白质降解、多肽降解和脂降解（6）分子遗传学基因克隆表达调控染色体分析InsulinGeneinsertedintoPlasmidRecombinantDNAAbsorbedbyBacteriaBacteriaProducesInsulinInsulinReadytobeAdministeredtoDiabeticPatients（7）益生菌（PROBIOTICS）LactobacillusandBifidobacterium食品级基因修饰菌是指被导入源于同种或公认的安全的食品级微生物的基因，因此具有某种优良性状的用于发酵食品生产的微生物。1、功能性基因必须源于同种菌或公认的安全的食品级微生物；2、载体必须是食品级的，不得含有非食品级的功能性DNA片段；3、选择性标记不得选用各种抗生素抗性标记。应选用食品级的标记基因，如糖类利用标记、营养缺陷型标记等；4、宿主菌的遗传特性清楚且稳定，具有足够的安全性，应选用适当的分子生物学方法如DNA序列分析、杂交等确定宿主菌的遗传组成。食品级载体不但是GRAS微生物，而且不依靠抗生素抗性作为选择标记，因而更为安全，在食品、医药方面具有广泛的应用潜力。乳酸菌的食品级高效诱导分泌表达NICE系统是可控制的蛋白质生产的最理想的系统。4、链霉菌基因表达系统（GeneExpressionsysteminStreptomyces）1）特点大多数来自于土壤能形成孢子的革兰氏阳性菌有复杂的形态（以无中隔分枝菌丝方式生长）和生理生命周期产生多种次级代谢产物基因组是大肠杆菌的两倍，GC含量高，平均为74%2）链霉菌的载体（1）高拷贝载体pIJ10140-800拷贝硫链丝菌素（tsr），新霉素（neo），酪氨酸酶（mel）（2）低拷贝载体pIJ9201-2拷贝广泛宿主能插入大于30kb的片段（3）穿梭载体pHJL210（SCP2*/pBR322）（4）柯斯载体（cosmid）构建基因文库（5）接合转移载体pBR322/pIJ101/RK2（IncP）（转移功能）（6）噬菌体载体C31衍生的，如KC304，KC505（7）表达载体利用PtipA启动子构建的表达载体pIJ6021（8）分泌载体利用S.longisporus分泌的枯草杆菌素抑制剂subtilisin（SSI）分泌和抑制丝氨酸蛋白酶特性构建如pIJ702（9）其他载体（A）大容量载体细菌人工染色体BAC利用F因子复制起始点/par元件，1-2拷贝，克隆100-300kb的片段（B）整合型载体利用pSAM2整合元件构建的pPM927（C）高表达载体整合高表达载体pCJR24，是利用天蓝色链霉菌A3中的激活调节基因actII-ORF4与actI基因启动子构建的3）链霉菌基因转移的方法（1）原生质体转化转化率不高,制备过程中影响因素多,系统对外源DNA的限制修饰作用（2）接合转移DNA以单链形式进入宿主菌大肠杆菌S17-1菌株,质粒RSF1010（3）电脉冲穿孔转化率比原生质体高10-100倍（4）噬菌体转导4）链霉菌基因的调控和蛋白质的分泌表达（1）RNA聚合酶基因多样性天蓝色链霉菌有两种不同形式的RNA聚合酶全酶32（与大肠杆菌有保守性）和49（发育阶段）多因子,双启动子研究表明天蓝色链霉菌至少有7个不同的因子,参与营养期,孢子形成,次级代谢等（2）调节基因A、途径专一调节基因（pathwayspecificregulator）具有链霉菌调节蛋白新家族(SARP)正调控因子B、全局调节基因（globalregulator）调控所有抗生素生物合成的调节基因absA编码双组分信号转导系统（3）调节因子小分子脂溶兼水溶的γ丁酰内酯作为激素样物质激发次级代谢和/或气生菌丝的形成（4）链霉菌中的蛋白外泌系统蛋白分泌机制大多数链霉菌的外泌蛋白前蛋白中有N端信号序列，它们的外泌依靠Sec-介导的分泌系统。现已从链霉菌中已克隆了SecA，SecY，SecD，SecE和SecF类似物。SecA(Blancoetal.1998)属于膜相关的转位ATPase,它阻止分泌前蛋白形成三级结构前体，促进前蛋白定位于分泌的转位酶上。蛋白的转位和穿膜链霉菌中蛋白的转位与穿膜机制尚未搞清，如将IL-2与tendamistat信号肽融合，在链霉菌中只有1/20翻译产物转位（translocation）至培养基和积累在胞内。5）影响链霉菌中基因表达的因素（1）启动子对外源基因表达的影响（2）信号肽对外源蛋白分泌的影响A、信号肽N末端氨基酸序列正电荷数对基因表达的影响B、信号肽切割位点后的氨基酸数对基因表达的影响C、信号肽和目的蛋白之间的距离对基因表达的影响（3）密码子、SD序列和终止子等对基因表达的影响链霉菌中翻译起始密码子为ATG或GTG，终止密码子为TAA或TAG（4）DNA扩增序列对基因表达的影响（5）发酵条件对外源基因表达的影响6）链霉菌表达系统优缺点及研究发展趋势（1）优点：链霉菌工业化培养条件成熟,适合于大规模产业化链霉菌基本为非致病菌,不产生内毒素可以进行高密度培养,在稳定期仍能维持异源蛋白的产生链霉菌可分泌胞外酶,利用信号肽可分泌外源蛋白链霉菌中有许多可利用的转录起始信号,利用它可以高表达外源基因（2）缺点：由于研究链霉菌表达有生物活性的真核来源的蛋白还处于初级阶段,许多实验结果不具有普遍规律,存在的问题有下列方面高活性启动子信号肽切割位点的氨基酸序列蛋白酶的水解次级代谢可控制启动子翻译后加工（3）研究发展趋势结合基因组学和转录组学,完善基因表达系统优化组合强启动子,信号和先导肽,从分子水平研究其结构元件与功能的关系在蛋白水平研究蛋白的分泌机理,特别是蛋白的转位和转膜机制研究次级代谢产物生物合成酶系的结构,构建新化合物文库,用于新药的开发5、酵母菌表达系统（GeneExpressionsysteminYeast）*1996年，完成了酵母基因组DNA（1.25x107bp)全序列测定工作。Division:buddingDonotformfilamentsSomeformfilamentsSomecanmate.1）酵母菌基因表达系统的宿主特点：（1）安全无毒,不致病。（2）有较清楚的背景,容易遗传操作。（3）容易进行载体DNA的导入。（4）培养条件简单，容易进行高密度发酵。（5）有良好的蛋白质分泌能力。（6）有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。2）酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）酿酒酵母是最早发展的真核基因表达系统。已表达和生产乙型肝炎疫苗、人胰岛素、干扰素等。酿酒酵母的不足之处：（1）发酵时会产生乙醇，乙醇的积累会影响酵母本身的生长，因此较难进行高密度发酵。（2）蛋白质的分泌能力较差。（3）虽然能进行蛋白质的糖基化修饰，但是与高等真核生物的相比，所形成的糖基侧链太长。过度的糖基化会引起副作用。3）毕赤酵母（Pichiapastoris）优点：（1）可以使发酵密度达到很高的水平；（2）分泌外源基因表达产物的能力强；（3）糖基化修饰功能更接近高等真核生物。不足：分子生物学的研究基础差，要对其进行遗传改造困难较大；不是一种食品微生物，