分子生物学绪论7468584239

分子生物学——生命科学领域的革命DNA的结构与功能RNA在蛋白质合成中的功能蛋白质的结构与功能、遗传密码的破译基因表达调控的本质被阐明人类开始了从生物学的必然王国向自由王国的大进军。分子水平的生物学研究，正越来越多地影响传统生物科学的各个领域分子生物学的3条基本原理构成生物体各类有机大分子的单体在不同生物中都是相同的生物体内一切有机大分子的建成都遵循共同的规则某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性分子生物学简史理论上的三大发现生物的遗传物质是DNADNA双螺旋模型遗传信息的传递方式技术上的三大发现基因操作的工具酶的发现载体的应用逆转录酶的发现1.理论上的三大发现1.1生物的遗传物质是DNAGriffith，1928：肺炎双球菌转化实验Avery，1943：体外转化实验Hershey，1952：噬菌体转导实验英国科学家格里菲思1879—19411928年，细菌学家Griffith肺炎双球菌转化实验无毒的R型菌与被杀死的有毒的S型菌混合后转化为有毒的S型活菌.说明S菌体内有一种转化因子OswaldTheodoreAvery（1877～1955）加拿大生物化学家艾弗里细菌转化实验1944年，Avery死去的S型菌并未复活，而是S型菌的DNA进入了R型菌，使其转化为新的S型致病肺炎双球菌。肺炎双球菌的转化实验注射R型活菌小鼠不发病（存活）注射S型灭活菌小鼠不发病（存活）注射S型活菌小鼠发病死亡注射R型活菌+S型死菌小鼠发病死亡心血分离到S型活菌⑴动物试验热致死S型菌培养皿培养无菌落生长R型活菌培养皿培养培养出R型菌落热致死S型菌+R型活菌培养皿培养培养出大量R型和S型菌落R型活菌+S菌抽取提物培养皿培养培养出大量R型和S型菌落⑵细菌培养试验AlfredDayHershey（1908～1997）美国微生物学家赫尔希噬菌体转染实验第一步：把宿主细菌培养在含有35S（或32P）培养基中，然后用T2噬菌体去感染，结果获得的子代噬菌体被标上35S或32P。第二步：标记了的噬菌体去感染未标记的细菌。1952年，美国Hershey噬菌体转染实验第三步：强烈搅拌洗涤，以便使吸附在菌体外表的T2噬菌体蛋白质外壳脱离细胞并均匀分布，再进行离心沉淀，分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。结果：几乎全部35S都在上清液中，而几乎全部32P和细菌一起出现在沉淀物中1952年，美国Hershey1.2DNA双螺旋模型1953Watson/Crick提出了DNA双螺旋结构模型；意义：对生命科学的发展作用可与达尔文学说媲美，与孟德尔定律齐名。从而使遗传学的研究全面进入分子遗传学阶段．DNA的模型的研究鲍林研究小组威尔金斯、富兰克林研究小组沃生、克里克研究小组鲍林(Pauling)研究小组主要工作：鲍林等1951年(提出蛋白质α-螺旋模型后)开始研究DNA分子结构。根据阿斯伯利Astbury等1938年获得的DNA分子晶体X射线衍射图像(显示DNA分子晶体呈螺旋结构)进行研究。提出DNA分子三链螺旋结构模型：引入多链、螺旋和氢链等概念。评价：虽然他们提出的模型并不正确，但是其研究方向和所采用的方法却为DNA分子结构模型研究确立了方向。注：1954年鲍林因研究物质聚合力而获得诺贝尔化学奖。威尔金斯、富兰克林研究小组主要工作成就：Wilkins和Franklin改进了DNA分子晶体X射线衍射图谱技术；于1951年获得了更为清晰的图像；结果表明：碱基位于螺旋内侧而磷酸基团在外侧，同时测得了DNA螺旋的直径和螺距。富兰克林拍摄的DNA晶体的X射线衍射照片，这张照片正是发现DNA结构的关键沃生、克里克研究小组Waston、Crick(1951-1953)：研究手段非常简单：用纸板等做磷酸、核糖和碱基模型，拼凑DNA分子的三维结构。理论知识深厚、富于创造性；视野广阔、收集信息全面并善于分析利用。基于已有的研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他们的第三个DNA双螺旋结构模型。（被公认为分子遗传学建立的标志）随后证明了DNA半保留复制的机理，解决了基因的自我复制和传递的问题Waston，Crick和Wilkins于1962年获得了诺贝尔生理学及医学奖。DNA双螺旋结构模型的意义DNA双螺旋模型结构同时表明了DNA复制的明显方式——碱基互补配对原则上的半保留复制。提示了基因和多肽成线性对应的一个可能理由：DNA核苷酸顺序规定该基因编码蛋白质的氨基酸顺序；DNA中的遗传信息就是碱基序列；并存在某种遗传密码，将核苷酸序列译成蛋白质氨基酸顺序。在其后的几十年中，科学家们沿着这两条途径前进，探明了DNA复制、遗传信息表达与中心法则等内容。1.3确定了遗传信息的传递方式1961年Monod和Jacob提出了操纵子学说；1964年Nirenberg等提出了“三联体密码说”；Crick提出了遗传信息流向和表达的中心法则这三大发现大大促进了生命科学的迅速发展，为基因工程的诞生奠定了重要的理论基础．GeneExpression中心法则(centraldogma)阐述了生物世代、个体以及从遗传物质到性状的遗传信息流向，即遗传信息在遗传物质复制、性状表现过程中的信息流向最初由Crick提出，并经过了多次修正2.技术上的三大发现2.1基因操作的工具酶的发现限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割DNA连接酶的发现与DNA片段的连接GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。限制酶命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口当一个DNA分子含有6个拷贝的GAATTC:它将被酶切成7个片段，可用凝胶电泳方法将其分离。(Thelargestfragment)(Thesmallestfragment)采用几种限制性内切酶组合可以使DNA分子产生特定的片段.e.g.EcoRI+HindIIIDNA连接酶(DNAligase)1967年在三个实验室同时发现的。活性：封闭DNA链上缺口，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键。要求：这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。DNA连接酶的作用机制细菌的DNA连接酶以NAD为能源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP为能源。T4的DNA连接酶可以连接平末端。重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基2.2基因运载工具—DNA载体的使用染色体外的遗传因子细菌的性因子—F因子Lederberg1946抗药性因子（R）大肠杆菌素因子（COE）质粒Cohen1973基因载体为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。6×Hisλ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列粘性质粒(cosmid)酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他载体2.3逆转录酶的发现逆转录病毒最早于1911年由Rous从鸡肉瘤组织中分离。1970年Baltimore和Temin发现逆转录病毒颗粒中带有逆转录酶，复制是通过DNA中间阶段，病毒DNA可整合于宿主细胞。这一发现改变了传统的分子生物学关于DNARNA蛋白质的概念,因而获得NobelPrize。分子生物学的研究内容DNA重组技术基因表达调控研究生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学基因组、功能基因组与生物信息学研究DNA重组技术（又称基因工程）将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定细胞中复制、表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，限制性内切酶、DNA连接酶及其它工具酶发现与应用则是这一技术得以建立的关键。Cohen等首次进行的DNA体外重组PSC101R6-3：质粒Ner：抗新霉素基因Sr：抗黄胺基因Tcr：抗四环素基因rcTreNSrSrNerTcrPsc101R6-3ECORIECORI转化E.coli连接酶细菌基因工程重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交重组DNA技术操作过程可形象归纳为分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体基因工程是创造奇迹的科学，有着惊人的发展潜力和极其广阔的应用前景“我们建议像缝纫一样，把基因连接到工业微生物中，促使它们生产大量的生命所需的蛋白质……这是生物和医学的真正大革命。我们Cetus人员预言，到2000年，事实上，所有人类主要疾病都将由杂种微生物生产的对疾病特异的人工蛋白质处理而得到治疗。”重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱DNA重组技术有着广阔的应用前景可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、酶类及抗体等，提高产量、降低成本，使许多有价值的多肽类物质得到广泛应用。可用于定向改造某些生物的基因组结构，使它们所具备的特殊经济价值或功能得以成百