分子生物学讲座(8)

4、调控基因(regulatorygene)是编码能与操纵子序列结合的调控蛋白的基因。调控方式有负调控(negativeregulation)和正调控(positiveregulation)。某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质中凡能引起诱导发生的分子称为诱导剂(inducer)，能导致阻遏发生的分子称为阻遏剂或辅助阻遏剂(corepressor)。在乳糖操纵元中，调控基因1acI位于P邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R，在环境没有乳糖存在的情况下，R形成分子量为152000的活性四聚体，能特异地与操纵子o紧密结合，从而阻止结构基因的转录；当环境中有足够的乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。在这过程中乳糖(实际起作用的是别乳糖)就是诱导剂。5、终止子终止子(terminator，T)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。说明：在没有乳糖存在的情况下，乳糖操纵元并非完全停止，还存在着本底组成型合成（backgroundconstitutivesynthesis）。因为阻遏蛋白和操纵子的结合并不是完全牢固的。也就是说，即使没有乳糖存在，也会有少数几个结构基因群得以合成，一旦有乳糖或者类似物存在，马上可以利用。和阻遏蛋白结合的是别乳糖，而不是乳糖。乳糖+H2O别乳糖葡萄糖+半乳糖β-半乳糖苷酶在研究诱导作用时，并不真正用乳糖进行，因为它会被催化降解。实际上用的是一些化学合成的乳糖类似物，例如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)。它不受β-半乳糖苷酶的催化分解，不被细胞代谢而十分稳定，但能与R特异性结合，使R构象变化，诱导1ac操纵元的开放。是很强的诱导剂。还有巯甲基半乳糖苷（TMG）。事例X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被β-半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal被广泛应用在基因工程的工作中。这些替代物都不是真正的酶的底物，所以称为安慰性诱导物（gratuitousinducer）。四、真核生物的基因调控1、真核生物基因组的特点真核基因组比原核基因组大得多真核生物主要的遗传物质在核膜内，核外还有遗传成分，增加了调控的层次和复杂性原核基本是单倍体，而真核是二倍体原核编码序列绝大多数是连续的，而真核绝大多数是不连续的原核基因组中重复序列不多，真核中则存在大量重复序列真核基因表达调控的环节更多真核基因转录与染色质的结构变化相关真核基因表达以正性调控为主2、真核生物基因调控的特点第五章DNA重组与基因工程前言基因工程属于生物技术范畴，生物技术（biotechnology）不是一个独立的学科而是一套技术或手段。广义的生物技术指任何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。一般认为生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞融合技术最为突出。蛋白质工程则是在基因工程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称为第二代基因工程。一般来说，基因工程是指在体外将核酸分子插入质粒、病毒或其它的载体当中，形成遗传物质的重新组合，使之进入到寄主细胞内，并且在寄主细胞当中可以持续稳定地繁殖。基因工程又叫做基因重组，DNA重组技术。第一节工具酶DNA重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多都用作工具。限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）在重组DNA技术中有重要地位，在此做详细介绍。一、工具酶种类1、限制性内切酶：分I、II、III三种2、连接酶：DNA连接酶、RNA连接酶3、聚合酶：DNA聚合酶、RNA聚合酶4、激酶、磷酸酶：碱性磷酸酶、T4多核苷酸激酶5、核酸酶：核酸外切酶、核酸内切酶（S1）、脱氧核糖核酸酶（DNaseI）、核糖核酸酶（RNaseA、RNaseH、RNaseT1）6、其他常用酶：甲基化酶、拓扑异构酶I、SSB二、限制性核酸内切酶的概念很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶。最常见的是甲基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制--修饰体系。其功能就是保护自身的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信息的稳定,这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。二、限制性核酸内切酶的命名按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。三、限制性核酸内切酶的分类按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同亚基构成，具有修饰酶活性和内切酶活性，它能识别和结合于特定位点，随机切断识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp（1000-5000bp）。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。III类限制性核酸内切酶：与Ⅰ类酶相似，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30bp（24-26bp）范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。II类限制性核酸内切酶：只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。四、限制性核酸内切酶的作用1、切割方式大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同。HindIII5`…AAGCTT…3`3`…TTCGAA…5`EcoRI5`…GAATTC…3`3`…CTTAAG…5`切割产生的末端有三种情况：3`粘性末端，PstI，5`-CTGCAG-3`5`粘性末端，EcoRI，5`-GAATTC-3`平末端，SmaI，5`-CCCGGG-3`2、识别序列频率1/4N，其中N=识别序列的长度3、同裂酶和同尾酶来源不同但可以识别切割相同的DNA序列，产生相同的末端，这样的酶称为同裂酶。如：MboI和Sau3AI（5`-GATC-3`）来源不同，识别切割的序列也不同，但产生相同的粘性末端，称为同尾酶。如SalI（5`-GTCGAC）和XhoI（5`-CTCGAG-3`）。4、影响酶切反应的因素1）盐浓度2）pH值3）甘油比例4）DNA纯度5）DNA甲基化