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微生物检查体系的调整2010版2015版分类依据按微生物类别分按营养条件分质控分类细菌、真菌需气、厌气菌检验体系选择培养、或者人为区分直接与培养条件对应项目1细菌数营养琼脂需氧菌总数胰酪大豆胨琼脂（TSA）项目2霉菌及酵母菌总数玫瑰红钠琼脂霉菌及酵母菌总数沙氏葡萄糖琼脂（SDA)评价容易造成漏检简便、严谨微生物检测环境变化2010版2015版检测环境应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内进行应在受控洁净环境（不低于D级洁净环境）下的局部洁净度不低于B级单向流空气区域内进行·其他要求：▷检验过程及环境既要最大可能防止样品受污染，又要防止检验过程对环境和人员造成的危害。▷活动区域的合理规划及区分，提高微生物实验操作的安全性和可靠性。控制菌项目变化培养基体系2010版2015版明显变化大肠菌群耐胆盐革兰阴性菌大肠埃希菌大肠埃希菌沙门菌沙门菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌无明显变化梭菌梭菌白色念珠菌白色念珠菌《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》通用要求要点：(1)微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。本检查法可采用替代检查方法，包括自动检测法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。（9201）药品微生物检验替代方法验证指导原则(2)环境洁净度应符合要求。定期检测：不低于B级的单向流空气区域、工作台面、环境。参考USP〈1117〉实验室分区原则。(3)前处理：供试品的抗菌活性，中和剂和灭活剂的有效性及无毒性。表面活性剂的无毒性及与相容性。(4)方法选择：根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择。（平皿法、薄膜过滤法和MPN法）(5)菌种管理：（9203）药品微生物实验室质量管理指导原则关于菌株管理的要求。(6)阴性对照：微生物检查需进行阴性对照试验。如果对照有菌生长，应进行偏差调查。试验菌2010版2015版大肠埃希菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉(1)胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。(2)胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌。(3)沙氏葡萄糖琼脂：白色念珠菌、黑曲霉。微生物计数用培养基2010版2015版1、营养琼脂用于细菌计数2、玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵母菌计数4、菌液制备用稀释液：0.9％氯化钠溶液1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧菌总数测定2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定3、沙氏葡萄糖琼脂+抗生素用于细菌超标引起霉菌和酵母菌总数超标用4、菌液制备用培养基：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液2010版2015版试验菌株1、营养琼脂：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌2、玫瑰红钠琼脂：白色念珠菌黑曲霉1、胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉2、胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3、沙氏葡萄糖琼脂：白色念珠菌、黑曲霉培养基适用性检查2010版2015版检查范围固体培养基微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的固体和液体培养基加菌量50~100CFU不大于100CFU培养温度营养琼脂：30~35℃玫瑰红钠：23~28℃胰酪大豆胨琼脂TSA：30~35℃培养胰酪大豆胨肉汤TSB：30~35℃培养沙氏葡萄糖琼脂SDA：20~25℃培养培养时间细菌：48h真菌：72h细菌不超过72h，真菌不超过5天可接受标准70%固体培养基（与对照培养基）：50%~200%（0.5~2）液体培养基（与对照培养基管比较）：生长良好建议：培养基呈混浊的液体，或划线于相应的分离平板上，培养后呈现典型菌落培养基适用性检查培养基名称沙氏葡萄糖琼脂+抗生素（当细菌超标引起霉菌和酵母菌总数超标用）无菌性检查取已灭菌的SDA注皿，用于20~25℃培养5~7天，应无菌落生长。试验用菌种抑菌性检查：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌促生长能力：白色念珠菌、黑曲霉常用抗生素1、庆大霉素：广谱。对G-，G+菌有比较好的抗菌作用2、氯霉素：广谱。对G-菌作用强；对G+菌作用不及青霉素与四环素。接种方法抑菌性：接种不小于100cfu试验用菌。促生长能力：接种不大于100cfu试验用菌。适用性检查白色念珠菌、黑曲霉于20~25℃培养不大于5天。与对照培养基比较，恢复率在50%~200%之间。枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌应不得生长。计数方法适用性试验1、常用的供试液制备方法(1)水溶性供试品(2)水不溶性非油脂类供试品(3)油脂类供试品(4)需要特殊方法制备供试液的供试品：①膜剂、②肠溶及结肠溶制剂、③气雾剂喷雾剂、④贴剂。2010版2015版(1)PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(2)PH7.2无菌磷酸盐缓冲液(3)PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）(1)PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(2)PH7.2无菌磷酸盐缓冲液(3)PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）(4)增加胰酪胨大豆肉汤培养基●不局限上述稀释液2、接种和稀释2010版2015版试验组供试液和菌液同时加入平皿中供试液，加入试验菌液，混匀，使每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。供试品对照组供试液直接加入平皿中稀释也代替菌液同试验组操作。（中国药典特殊规定的，协调案无相关要求）菌液对照组直接加入菌液到平皿中不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作。中和剂对照组稀释剂对照组中和剂、灭活剂及表面活性剂的稀释液中加入规定量菌液接种和稀释消除供试品的抑菌活性的方法（1）增加稀释剂和培养基的用量；（2）加入中和剂或灭活剂；（3）采用薄膜过滤法和冲洗；（4）综合上述措施。●根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检测。培养条件2010版2015版细菌数：营养琼脂30℃~35℃3天需氧菌总数（TAMC）：胰酪大豆胨琼脂30℃~35℃3~5天霉菌及酵母菌数：玫瑰红钠琼脂23℃~28℃5天霉菌及酵母菌总数（TYMC)：沙氏葡萄糖琼脂20℃~25℃5~7天结果判断计数方法结果判断薄膜过滤法平皿法（试验组菌落数—供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数比值应在0.5~2之间MPN法试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品检查。MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。供试品检查部分1、操作2010版2015版按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液的制备，用稀释液稀释成1:10、1:102、1:103等稀释级的供试液按照计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。USP36〈1227〉推荐细菌及酵母菌计数范围:25-250cfu/皿霉菌计数范围：8-80cfu/皿供试品检查部分2、培养2010版2015版（1）描述方式：计数方法包括平皿法和薄膜过滤法，检查时，按已验证计数方法进行供试品细菌、霉菌和酵母菌数测定。（2）培养条件：细菌30~35℃培养3天，霉菌和酵母菌23~28℃培养5天，必要时可适当延长7天。（1）描述方式：按计数方法适用性试验确认计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的测定。（2）培养条件：胰酪大豆胨琼脂平板在30~35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂平板在20~25℃培养5~7天；MPN法和供试品接种，所有试验管在30~35℃培养3天。供试品检查部分-结果判断2010版2015版若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌及酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查。如采用MPN法，测定结果为需氧菌总数。供试品检查部分-结果判断2010版2015版供试品的细菌数、霉菌数和酵母菌数其中任何一个不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以三次结果的平均值报告菌数。无相关内容描述。在实际操作过程应依据附录9203药品微生物实验室质量管理指导原则：结果的判断和检测报告----异常结果出现时，应进行偏差调查。需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；霉菌及酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂上生长的细菌使霉菌及酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂或选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）供试品检查部分-计数标准2010版2015版无规定增加：各品种项下要求执行的微生物限度标准解释如下：101cfu为可接受的最大限度为20；102cfu为可接受的最大限度为200；103cfu为可接受的最大限度为2000；以此类推。若供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。2010版2015版无规定例如：当标准为10cfu，不同于以往10cfu规定的以10的指数规定标准，考虑了微生物计数结果的可变性，即计数结果的精密度，而非类似化学检验结果。故要求我们需要在结果判断时或制定内控标准时，对于结果的判断或历史数据的分析需要用风险分析的手段进行评估。制定标准时需要依据历史数据，工艺过程，用药人群等进行相应分析，制定合理的内控标准，即总原则为在内控标准的控制下产品无任何质量风险。基于数据分析和风险评估制定标准-尽管未超过标准规定，但是有风险。-累积数据，建立风险评估体系《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》通用要求要点：(1)控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。本检查法可采用替代检查方法，包括自动检测法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。（9201）药品微生物检验替代方法验证指导原则。(2)供试液制备及实验环境要求同《非无菌产品微生物检查：微生物计数法》参考USP〈1117〉实验室分区原则。(3)前处理：供试品的抗菌活性，中和剂和灭活剂的有效性及无毒性。表面活性剂的无毒性及与相容性。(4)在各控制菌项下：生化实验和“应进行分离、纯化及适宜的鉴定实验。”改为较少的生化实验或“采用其它适宜方法进一步鉴定。”控制菌结果判断趋向多样化▷控制菌检查中将原来大肠菌群的检测改为耐胆盐的革兰氏阴性菌，另外培养基体系也有较明显的变化，较少的生化实验或采用其它适宜方法进一步鉴定（镜检、生化、色谱光谱技术、分子生物学等）2010版2015版大肠菌群耐胆盐革兰阴性菌大肠埃希菌大肠埃希菌沙门菌沙门菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌梭菌梭菌白色念珠菌白色念珠菌供试品检查部分-耐胆盐革兰阴性菌大肠菌群的定义是指在37℃生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰阴性、氧化酶阴性、需氧或兼性厌氧的无芽孢杆菌。它不是分类学上的名称。符合上述定义的菌除埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌