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1亲们：曾老师发来的实验讲义，请下载打印，每次课带相应的讲义。1.下周一实验1点开始，切记时间不要迟到哟。2.作业：第一次（今天）的实验报告，还有“大吞噬”和小吞噬的图。3.漂亮美女们要把头发扎好，为自己的健康着想哟。实验一小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验【原理】吞噬细胞具有对异物(细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等)吞噬和消化的功能，在机体固有免疫中发挥重要作用。【目的】1.通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义。2.掌握小鼠腹腔注射给药和摘眼球放血及脊椎脱臼处死的方法。【材料】小鼠、2％鸡RBC（CRBC）、尖吸管、玻片、瑞氏染液、眼科剪、弯头眼科镊、1mL注射器【方法】10％的硫乙醇酸钠溶液腹腔注射1ml（诱导腹腔巨噬细胞大量渗出）（4d）2％CRBC腹腔注射1ml（45min）摘眼球放血，处死小鼠轻揉腹部1min，剪开表皮，暴露腹膜，剪一小口，取腹腔液（用尖吸管）滴于玻片一端推片（自然干燥）瑞氏染色（10min）冲洗，印干，镜检【注意事项】⒈腹腔注射时勿注入皮下；⒉染色时玻片勿互相碰触；⒊观察时注意玻片正反面。结果：吞噬百分率＝吞有SRBC的吞噬细胞/100个吞噬细胞×100％吞噬指数＝所吞SRBC数/100个吞噬细胞2附：⒈2%CRBC悬液的制备：吸取在阿氏液中保存的CRBC沉淀0.3mL，置于玻璃试管内，加入2mL生理盐水，混匀，2000rpm,5min离心，此为洗涤红细胞。离心毕，观察上清，如无溶血现象，即可弃上清，取红细胞沉淀（即为压积红细胞）0.2mL，移入15mL离心管中，以10mL注射器吸取生理盐水10mL加入，混匀，即为2%CRBC悬液。若洗一次后仍可见溶血现象，则重复第一步，直至无溶血发生，方可配制实验用红细胞悬液。⒉摘取胸腺，脾脏。均为重要的免疫器官，做动物实验获取免疫细胞的重要来源示教片：大吞噬实验：即本实验结果；小吞噬实验：外周血嗜中性粒细胞吞噬葡萄球菌（标本片示教）实验二淋巴细胞转化实验（MTT法）一、原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。二、材料：小鼠、鼠板、眼科剪、眼科镊、75%乙醇湿棉球、小平皿、200目筛网、研棒（注射器针芯）、细胞计数板、盖玻片、加样器（1mL、200uL、20uL）及枪头、96孔血凝板、15mL离心管、4mLEP管、96孔板、白细胞计数液、MTT、ConA、无菌PBS、Tris-NH4Cl、完全1640(含10%FBS、1%双抗)、0.01NHCl-10%SDS、无菌针头过滤器、10mL注射器、废物（液）缸、冰浴、无菌操作台、CO2培养箱，显微镜、酶标仪，冰箱、低温离心机。试剂的准备：1.MTT：称取50mg的MTT，溶于10mlPBS后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，1mL/管，-20℃避光保存。2.ConA：25mg/瓶，Sigma出品。取25mg，溶于25mLPBS中，终浓度为1mg/mL，过滤除菌，无菌EP管分装，1mL/管，-20℃保存。用时取1mL，以无菌PBS稀释为100ug/mL（即稀释10倍）。3.PBS：取市售配好的PBS粉末一袋，加1000mL蒸馏水，混匀，高压或过滤除菌，4℃保存。4.0.01NHCl-10%SDS：设市售浓HCl为10N（实际约为11N），取0.1mL加99.9mL蒸馏水稀释为0.01NHCl100mL；称取10gSDS，置于100mL量筒内，以上述HCl溶解，使终体积为100mL，即得0.01NHCl-10%SDS。5.完全1640:取市售RPMI164089mL，加1mL100×双抗、10mLFBS，即得含10%FBS的完全1640.36.Tris-NH4Cl（红细胞裂解液）：称取3.735g氯化铵、Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.3g加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。无菌器械的准备：1.200目筛网、研棒、平皿：提前1d高压灭菌，烘干备用。2.手术器械：临用前酒精擦拭或浸泡、酒精灯火焰灭菌。3.冰浴：将碎冰置于一白色浅盘(或小塑料泡沫盒)内，备用。（三）实验方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠摘眼球放血、脱颈椎处死，75%乙醇湿棉球擦拭腹部，置于鼠板上固定；（2）在小鼠腹部中间部位剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，另一镊子分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml无菌PBS液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液:无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（200目）上，置于盛有适量无菌PBS的小平皿中，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用PBS洗3次，每次离心2000r/min5min。取出10μl，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，调整细胞浓度为5×106/ml。细胞计数的方法：①稀释脾细胞：在96孔血凝板内分别加白细胞计数液90μL/孔，根据细胞数量加2-3个孔；取脾细胞悬液10μL，依次10倍稀释。②取最后1孔的细胞悬液10μL置于白细胞记数板槽内，待细胞不再移动，100倍镜下进行细胞计数。1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3ml=10-4ml细胞浓度:细胞数/ml=5个中格的细胞数x5x104（RBC计数法）细胞数/ml=4个大格的细胞总数/4x104（WBC计数法）③根据细胞计数结果，取适量细胞以完全1640稀释为5×106/mL2、淋巴细胞增殖反应：将5×106/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，100ul/孔，加6个孔，再加培养液100μL/孔；前3个孔加ConA10μL/孔(终浓度5μg/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。置5％CO2，37℃培养72h。43.在培养结束前4-6小时，先将各孔中培养液小心吸出100μL/孔，注意加样器枪头勿碰触细胞；于培养板各孔内加入5mg/mlMTT液，10μl/孔。37℃培养。4.4-6小时后，各孔内加入0.01NHCl-10%SDS100μl,振荡摇匀，37℃过夜。5.用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。抄录数据。（四）实验结果取实验组和对照组三个复孔的平均OD值。转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。注意事项（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。（3）为保持细胞活性，所有步骤（除破坏红细胞时）均需在低温或冰浴中进行。实验三-1凝集实验原理：是颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的凝集反应(agglutination)。细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下，两者特异性结合且进一步聚集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应。反应中的抗原称为凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin）。分类：直接凝集试验、间接凝集试验、间接凝集抑制试验等血球凝集试验：属直接凝集试验材料：1％SRBC、1：20溶血素、生理盐水（NS）、24孔凹孔板、0.2mL加样器及枪头、37℃恒温箱方法与步骤：对倍稀释法（第12孔为阴性对照，37℃，2h，4℃静置过夜12345。。。。。。。。。。。。1112生理盐水（ml）0.20.20.2溶血素（ml）0.20.20.2弃去1：401：801：1601%SRBC（ml）0.20.20.2结果判定：＋＋＋＋全部凝集，血细胞明显凝集，甚至成片卷曲，上清清亮＋＋＋两者之间，血细胞凝集成片，上清发红，略不清亮＋＋一半凝集，一半沉淀，血细胞均半数凝集，周围散在颗粒，上清呈混悬＋两者之间，血细胞在孔底形成一圆点，周围可见少量凝集，上清更加浑浊－一点儿也不凝集，血细胞在孔底形成边缘整齐，光滑的点状，上清澄清效价：即滴度，是出现明显凝集现象（＋＋）的抗体的最大稀释度。5实验三-2抗体形成细胞检测――溶血分光光度计法QHS实验原理：定量溶血分光光度法(quantitativehemolysisspectrophotometry，QHS)该法又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光度法，是根据溶血空斑试验的原理衍化而来，可用以测定由B细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白(以吸光值表示)，从而反映机体的体液免疫功能。试验时，将免疫的脾细胞与SRBC及新鲜豚鼠血清等体积混合，于37℃水浴1小时，离心后测上清吸光值，其与产生抗体的量成正比。实验材料：5%SRBC、SRBC（以生理盐水稀释成1.5×108/ml）、补体（三只豚鼠血清混合，以SRBC4℃吸收30min，3000rpm离心15min，上清1:10稀释备用）2×107/ml小鼠脾细胞、RPMI1640培养液、白细胞计数液、Tris-NH4Cl溶液、酒精棉球200目铜网、针芯（研棒）、冰浴（置于中号白托盘中）、眼科剪、弯头眼科镊2把、平皿（小号）、小滤器、10mL注射器、PBS、低温离心机、15mL离心管、1.5mL离心管若干、96孔血凝板（稀释细胞用）、96孔酶标板、各规格（1mL、200uL、10uL）加样器及枪头、显微镜、血球记数板、盖玻片、废物（液）缸、37℃孵箱、酶标仪实验方法：1.脾细胞的制备①5%SRBC免疫小鼠，1mL/只，4天后拉颈处死，取脾②200目铜网上研磨脾脏，收集脾细胞悬液，2000rpm离心5min，弃上清③Tris-NH4Cl室温作用10min，2000rpm离心5min,弃上清④洗细胞2遍：加5mlPBS液，混匀，2000rpm离心5min，弃上清⑤加1mlPBS液计数，调整细胞浓度为2×107/ml按下表分别向各管中加入所需材料实验管对照管脾细胞0.2ml0.2mlPBS液SRBC0.2ml0.2mlComplement0.2ml0.2ml•混匀，37℃孵育1h•3000rpm离心5min，取上清，加入96孔板，0.1mL/孔，实验组和对照组各设3个复孔•酶标仪测定413nm处OD值（Hb量）6实验四789实验五免疫细胞化学实验原理：应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。免疫酶标记法：以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位；·酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。1、常用的标记酶及其显色底物·辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)及底物·碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)及底物(1)辣根过氧化物酶(HRP)及底物·HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约40kDa，稳定性好；·底物为过氧化物和供氢体(DH2)–过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。–供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化型染料，最常用的供氢体是DAB。DAB(二氨基联苯胺)·DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。·目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。(2)碱性磷酸酶(AP)及底物·AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：-偶氮偶联反应，底物为-萘酚磷酸盐，经水解后得-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fastblue)或坚牢红(fastred)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。–靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodylphosphate,BCIP)，经酶水解