《分子生物学实验》

分子生物学实验指导书安徽农业大学生命科学学院遗传教研室二00三年元月1前言随着生命科学的发展，分子生物学技术已渗透到生命科学的各个研究领域，因而分子生物学实验技术也成为高校生物学及其相关学科专业学生应该了解和掌握的技术。过去在高校生物技术等本科专业开设分子生物学实验多以质粒DNA为材料，且往往与基因工程操作技术内容有重复。近年来，基因组学研究的进展，特别是与生物学研究和应用密切相关的分子标记技术越来越广泛地得到应用，而这些技术是建立在基因组DNA分子操作和分析技术之上的，这就迫切需要学生了解基因组DNA分子操作技术，所以本实验系统在内容和体系上进行改革，以植物基因组DNA为对象，建立一套基因组DNA提取、检测、扩增、酶切、杂交和特异片段回收等常用分子生物学实验技术，一方面避免与基因工程内容的交叉重复，更重要的是帮助学生了解和掌握生物基因组DNA基本的分子操作技术，以拓展和更新实验内容，提高学生动手能力和创新意识。2目录实验一植物基因组DNA的提取………………………………………3实验二植物基因组DNA的鉴定………………………………………4实验三植物基因组DNA的酶切、电泳及转膜………………………6实验四Southern杂交……………………………………………………8实验五随机PCR扩增反应与RAPD分析……………………………10实验六特定片段的分离回收与纯化…………………………………12附录各种试剂和缓冲液的配制……………………………………14主要参考文献……………………………………………………………153实验一植物基因组DNA的提取一、原理及目的基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。当加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到分离提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此提取基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿的抽提、混匀操作要温和，以保证得到较长的DNA片段。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带有合适末端的有效片段很少，而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。不同生物（植物、动物和微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，同种生物的不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时，必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获取可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此对富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以玉米嫩叶为材料，用SDS法提取基因组DNA。二、设备液氮罐，微量移液器，台式离心机，恒温水浴锅，研钵，7ml离心管等。三、试剂1.提取缓冲液：100mmol/LTris·Cl，20mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl、1.5%SDS。2.氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）3.TE缓冲液：10mmol/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）4.其他试剂：液氮，异丙醇，无水乙醇，70%乙醇，3mol/LNaAc（pH5.2）。四、操作步骤1.在7ml离心管中加入2ml提取缓冲液，60℃水浴预热。2.取玉米幼叶0.5~1g，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，摇动混匀，60℃水浴保温30~60min（时间长，DNA产量高），不时轻轻摇动。3.加入2ml氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静置5~10min，使水相和有机相分层。4.室温下5000rpm离心5min。5.小心移取上清液至另一7ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即4出现絮状DNA沉淀。6.用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净的吸水纸上吸干，放入含200μlTE的离心管中。若絮团太少，亦可直接在室温下5000rpm离心5min，去除上清液，再加入200μlTE溶解沉淀。7.加入1μlRNaseA(10μg/μl),37℃水浴保温30min,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。8.加入1/10体积（约20μl）的3mol/LNaAc及二倍体积（约400μl）预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置20min左右。9.室温下5000rpm离心5min。10.去上清，用1ml70%乙醇漂洗沉淀二次，待沉淀自然干燥后，重新加入200μlTE溶解，-20℃贮存，备用。五、注意事项1.分离的DNA质量由它的长度和纯度决定，为获得较长的DNA片段，应轻轻操作DNA溶液，快速冷冻植物组织以减少机械剪切力和核酸酶的切割。2.细胞裂解不完全，会导致DNA含量低，故应使用新鲜配制的裂解液，适当延长裂解时间来保证细胞裂解的效果。3.若DNA中含有蛋白质和RNA污染，可通过增加酚抽提的次数和效率来降低污染率。4.多糖和碳水化合物是植物DNA抽提中的主要污染物，幼嫩组织多糖含量较少。植物在暗处放置1~3天能减少组织中的淀粉和碳水化合物的含量。实验二植物基因组DNA的鉴定一、原理及目的琼脂糖凝胶电泳技术是分离鉴定和纯化DNA最常用的标准方法。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，琼脂糖凝胶适用于分离大小在200bp至50kb范围内的DNA片段。凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之浓度越低，孔隙越大，其分辨能力也就随之减弱。凝胶电泳的原理较简单，我们知道当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫电泳迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。当凝胶中带负电荷的DNA分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，凝胶中的溴化乙锭（（EthidiumBromide，EB）就会插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正5比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块可直接在紫外灯照射下拍照，只需5~10ng的DNA就可从照片上鉴别出来，并且通过凝胶成像系统可精确地测得样品的浓度。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移率与DNA分子量的大小、琼脂糖浓度、DNA的构象、电泳时电压及电泳缓冲液的组成等有关。待测DNA样品与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知样品的分子量大小。核酸凝胶电泳常用的指示剂是溴酚蓝。溴酚蓝的分子量为670Da，在不同浓度的凝胶中，迁移速度基本相同，迁移率与0.5kb的双链线性DNA片段大致相同。电泳分离样品DNA分子时，可以参照溴酚蓝指示剂的迁移情况决定是否停止电泳。由于指示剂中含50％蔗糖，所以溴酚蓝指示剂的另一个作用是增加上样DNA溶液的密度，确保DNA样品沉入点样孔内。紫外分光光度计检测DNA浓度的原理在于DNA（或RNA）分子在260nm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状双链、单链之间的转换，会导致吸收水平的改变，但这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便，但使用的紫外分光光度计较昂贵。本实验通过电泳检查、紫外检测来鉴定实验一中提取的玉米基因组DNA的浓度、纯度和质量。二、设备电泳槽，电泳仪，微量移液器，托盘天平，微波炉，手提式紫外检测仪，紫外分光光度计，凝胶电泳成像系统等。三、试剂1×TAE电泳缓冲液，6×溴酚蓝点样缓冲液，溴化乙锭（EB）贮存液（5mg/ml），琼脂糖，λDNA/HindⅢ+EcoRⅠMarkers。四、操作步骤1.电泳检查：（1）选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。（2）选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为1.0~2.0mm。（3）制备琼脂糖凝胶，根据被分离基因组DNA的大小，按0.7％浓度称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，置微波炉中或电炉加热，至琼脂糖熔化均匀。（4）用透明胶带将电泳槽四周密封好，防止浇凝胶时出现渗漏。然后在凝胶溶液中加入EB（EB最终浓度为0.5微克/毫升），摇匀，待凝胶溶液冷却至50℃左右时，轻轻倒入电泳槽水平板上，除去气泡。（5）待凝胶冷却凝固后，小心取出点样梳并撕掉两端透明胶带，注意保持点样孔的完6好。（6）在待测的DNA样品中，加1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录样品点样秩序与点样量，并以λDNA/HindⅢ+EcoRⅠMarkers为标准点样。（7）开启电源，电压不超过5V/cm。（8）当溴酚蓝迁移约2/3距离时，停止电泳。在紫外灯下观察电泳结果，亦可用电泳凝胶成像系统拍照，判断DNA样品的分子量大小及其浓度。2.紫外检测：取基因组DNA样品稀释至适当倍数，用紫外分光光度计测定波长260nm、280nm处的读数，同时对DNA进行200nm~400nm波长范围的扫描。根据OD260/OD280比值判断DNA质量，DNA纯品的OD260/OD280比值为1.8，若样品中污染有蛋白质或酚，其比值将明显低于此值。若比值大于2.0，则为RNA污染。在260nm的波长下，OD值为1相当于大约50μg/ml的双链DNA，因此，根据DNA样品在260nm的读数可计算DNA样品的浓度。DNA样品的浓度按下式计算：C（μg/ml）=OD260×50×稀释倍数五、注意事项1.电泳点样操作的好坏与电泳结果关系密切，点样前应将样品与上样体积1/5的溴酚蓝指示剂混合均匀后点样。2.紫外灯对人的皮肤和眼睛有照射损伤，要避免灯直接照射到皮肤和眼睛。3.EB是强诱变剂，操作时要戴手套。实验三植物基因组DNA的酶切、电泳及转膜一、原理及目的DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制片段长度多态性）已被广泛应用于基因组图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确定生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种和不同种基因组DNA的克隆，它们位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可繁殖及保存。不同限制性内7切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因而通过杂交可获得不同类型和数量的分子标记。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。此外，当检测某个基因在基因组中的拷贝数或外源基因在基因组中的整合情况时，一般采用Southern杂交来检测。同样也要用不同的限制性内切酶对植物基因组DNA进行消化，消化既可以是单酶切，也可以是双酶切或多酶切。选择被检测的基因内部无消化位点的酶进行消化，酶切后应产生被检测的DNA片段，通过杂交即可获得足够的信息。本实验将利用实验一提取的基因组DNA为样品，学习基因组DNA的酶切、电泳分离酶切片段