化学与生物工程系

1化学与生物工程系：细胞生物学实验指导专业：生物技术指导老师：陈春岚PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建实验一细胞和细胞内含物的观察细胞质内含有多种细胞器。有些细胞器如线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体等普遍存在于各种细胞中，而另有些细胞器如叶绿体，只存在于植物细胞中。细胞质内的这些结构，除叶绿体外，一般在光学显微镜下不易看见，必须经过一定的固定染色方法处理后，才能看到大多数细胞器，或直接用相差显微镜观察。线粒体线粒体是一种动态的易变结构。经过处理在光学显微镜下呈现为颗粒状、棒状或弯曲细线。线粒体的形态和数量随不同生物、不同组织及不同生理状态而发生变化，例如肝细胞、胰细胞的线粒体通常呈线状，成熟的卵细胞内线粒体呈颗粒状，肾细胞内的线粒体呈棒状。显示线粒体的方法可以概括为以下几种：1、生活细胞的观察。如将组织培养细胞或其他生活细胞，放在相差显微镜下，就可以看到细胞质内有线状小体活动，这就是线粒体。2、活细胞染色法。就是利用某些无毒或毒性较小的染料，显示出细胞内某些特殊结构存在的真实性，而并不对细胞的活动有影响，如JanusgreenB（詹纳斯绿B），就是一种毒性较小的碱性染料。将其配制成一定浓度，对活细胞进行染色，在细胞质内可以看到被染成蓝绿色的线状或颗粒小体，这就是线粒体。还可看到其在细胞质内的活动状况。线粒体所以能显示出蓝绿色，是由于线粒体中具有细胞色素氧化酶系统，它是染料始终处于氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中的染料被还原呈无色。3、固定染色法（即永久制片法）。用特殊的固定液染色处理动物的组织或细胞后，可显示出线粒体的形态。但所用材料必须新鲜，否则线粒体常因已经破坏而显示不出，线粒体的组成成分主要是脂蛋白，脂类又以磷脂为主，用于线粒体的固定液含有饿酸，重铬酸钾等。因为两者均能使脂类物质保存下来，故可显示出线粒体的形态。用于显示线粒体形态的固定、染色方法较多，常用的有Altmann染色法、Regand染色法及Chmpy-Kull染色法等，但欲显示线粒体的细微结构，则要用电镜技术。4、生化分离提取方法。在一定的低温条件下，将组织细胞破碎制备成匀浆，用于线粒体组分及其在不同生理状态的分离分析研究。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建高尔基体高尔基体显示的方法，目前使用较多的是：1．固定染色法。1889年Golgi用镀银的方法显示出这种细胞器，目前仍应用AgNO3或饿酸处理材料，将高尔基体显示为棕黑色。这是由于AgNO3、饿酸在高尔基体的部位被还原之故，所以显出高尔基体的形态及其在细胞内的分布。常用的方法有DaFano硝酸钴-硝酸银镀银法，Aoyama镀银法及RomonyCajal镀银法等，而欲显示其细胞结构，就得使用电镜技术。2．活体染色法。将中性红配制成一定的浓度，对细胞进行活体染色，以显示高尔基体。但此种显示高尔基体的方法，仍不如詹纳斯绿显示线粒体的方法更为广泛。因为中性红只能染高尔基体的液泡部分，因此有一定的局限性。一、目的与要求本次实验的重点是观察线粒体及高尔基体形态及其在细胞内的分布，主要观察永久制片，同时也做一些活体染色的观察。此外，还要与电镜照片比较，以进一步了解认识这两种细胞器的超微结构。其次，还应知道细胞质内除上述两种细胞器之外，还有其他的细胞器如叶绿体、中心体等，细胞质内除细胞器外，还有内含物如脂类，多糖等。二、实验内容1．线粒体的观察2．高尔基体的观察3．叶绿体的观察4．细胞内含物（多糖、脂滴、淀粉粒）的观察三、实验步骤（一）线粒体1．永久制片的观察本次实验所用标本是按Regand染色法制作的。简单的讲，这种方法，所选用的固定剂是重铬酸钾和福尔马林，材料经过固定、脱水、透明、包埋于石蜡中；在经切片制成薄切片标本；然后，用铁矾苏本精进行染色，细胞质内的线粒体被染成蓝黑色（详细制作方法见本实验末附录）。观察制版标本时，要注意线粒体在不同细胞内的心态及在细胞质内的分布部位。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建（1）兔肝细胞：先在低倍镜下找到标本，再换高倍镜观察，肝细胞为多角形的较大细胞，细胞中央有一圆形细胞核，此时换上油镜头，再继续观察，注意在肝细胞只能感线粒体是什么形状？它们在细胞质内是怎样分布的？按上述方法继续观察其他标本。（2）小鼠肾细胞：肾小管细胞为方形，在细胞核周围被染成蓝黑色的是线粒体，仔细观察它们是什么形状？（3）小鼠肠细胞：细胞呈长柱状，注意线粒体形状及在细胞内的分布？2．活体染色标本的制作与观察（1）活体染色所用染色剂的一般要求染料浓度：一般是非常稀的，詹纳斯绿作为活体染液，它的使用浓度范围在1/3000—1/10000，也有人用1/30000浓度。使用浓度要依不同材料而异，如对植物细胞线粒体的活体染色，可用1%，配制时可用等渗盐水，如生理盐水或Ringer液。配制时间：宜在使用时配制新鲜液，不可久存。（2）鼠肝细胞线粒体的活体染色：剪断颈动脉，放血处死小鼠，剖腹，取出肝脏，放在滴定板上。沿肝脏边缘，用刀片切取2—3mm厚的切片，置滴定板的凹孔内。加2—3滴1/10000浓度的詹纳斯绿染液，染色20—30分钟。取出肚脏，用生理盐水洗去染料，再用刀片切取很薄的小片，置载片上。滴一滴生理盐水于肝切片上，加上盖玻片，再放上一张小滤纸，用拇指猛压载片，使细胞分离或压碎。观察时，先在低倍镜下找到完整的肝细胞，再在高倍镜下观察细胞质内的线粒体。（3）洋葱鳞片表皮细胞线粒体的活体染色：取一载玻片，在其中央加一滴0.5%詹纳斯绿染液。用镊子从洋葱鳞片的内表面撕下一小块表皮，放在载玻片上的染料中，并使其展开，染5—10分钟，用吸管吸取蒸馏水，滴于染色的载玻片上，使染液冲淡，最后使标本周围液体近于无色。此时，用镊子取一盖玻片，先将它的一边轻轻接触到载玻片染液的边缘。此时再慢慢地放下盖玻片，这样可以避免出现气泡。如载玻片上水过多，可用一吸水纸从盖玻片的一侧吸去过多的染液。此时，可放在显微镜下进行观察。先用低倍镜进行观察，找到细胞后，即可转入高倍镜继续观察，此时，要注意细胞核位于细胞的近中部的一侧。在它的周围有致密的原生质体，在原生质中PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建有被染成蓝绿色的小颗粒。此即线粒体。3．电镜照片的观察观察了光学显微镜的线粒体以后，在观察线粒体的电镜照片。在电镜照片上，可以看到，线粒体不是一个简单的杆状或颗粒状，从切面看它是一个具有双层膜的小囊：外膜完整、内膜连续不断地向线粒体的基质褶入，形成一些列双膜的嵴（cristae）.嵴的形状和数目随细胞不同而异。可以说线粒体是一个复杂的膜系统。（二）高尔基体本实验所用标本是按Aoyama镀银法制作的，简单地讲。在制作中，首先将材料放于含有氯化（）和福尔马林的固定剂中，进行固定，然后镀银，若干小时后，取出放入还原液。最后，经脱水、包埋、切片，制成薄切标本。用这种方法制成的标本，在细胞内的高尔基体被显示为棕黑色（详细方法见本实验末附录）。1．高尔基体永久制片的观察。在兔神经节细胞核的周围原生质中，可看到棕黑色的网状物，此即为高尔基体。2．高尔基体电镜照片的观察在观察了光学显微镜下的高尔基体后，在观察示范电镜照片，注意高尔基体是由几部分组成的。（三）叶绿体叶绿体—示范：叶片横切面上，在叶肉细胞质部位有许多圆形颗粒，此即叶绿体。此种材料，亦可取新鲜叶片，用刀片做徒手切片或用镊子撕下菠菜叶肉细胞将切片放于载玻片上，滴一滴蒸馏水，加上盖玻片，即可在显微镜下直接观察绿色的叶绿体。在电镜下，叶绿体和线粒体一样，也显示为一个复杂的膜系统，对照电镜照片你能说出叶绿体的超微结构吗？（四）细胞内含物1．多糖：观察小鼠肝细胞的永久制片，肝细胞内储存有大量的肝糖，可以用PAS反应显示肝糖在细胞内存在的部位。2．脂滴：取花生的子叶，用徒手切片法，切成薄片，放于载玻片上，加一滴苏丹3染液染色5分钟，用蒸馏水洗去染液，加盖玻片，即可进行观察，观察时注意脂滴的颜色及其在细胞内的分布。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建．淀粉：取一块马铃薯，用徒手切片法，切成薄片，将薄片放于载玻片上的水滴中，加盖玻片后即可观察，先观察一下淀粉粒的形状及在细胞内的分布，然后在加碘液染色5分钟，用蒸馏水洗去染液，加盖片观察。四、习题1．绘图表示在光学显微镜下所显示的线粒体及高尔基体的形状及其在细胞内的分布。2．请设法检测花生子叶中有无淀粉颗粒？或马铃薯中有无脂滴？附录：高尔基体永久标本的制作（一）显示高尔基体—DaFano氏硝酸钴镀银法1．溶液的配制（1）硝酸钴溶液：硝酸钴1g中性福尔马林15ml蒸馏水35ml（或用乙醇或甲醇30ml，中性福尔马林15—20ml，水80ml配制）（2）硝酸银溶液：硝酸银1.5g蒸馏水100m（3）还原剂：对苯二酚1—2g中性福尔马林15ml亚硫酸钠0.1—0.5g蒸馏水100ml2．镀银步骤（1）固定：在硝酸钴溶液中固定10—24小时，但不宜超过24小时；（2）蒸馏水快洗；（3）室温下在硝酸银溶液中放置36—48小时；（4）蒸馏水冲洗；（5）还原剂中还原，8—24小时；（6）蒸馏水洗，快步脱水，透明，包埋；PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建（7）切片—帖片—脱蜡到水—封片；（8）镜检，高尔基体呈黑色，细胞质呈黄色。实验二DNA显示和细胞有丝分裂相的观察核酸是生物最重要的组成成分,核酸分为两大类,即脱氧河塘核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。它们在细胞内的分布及化学性质均有所不同。DNA主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内。RNA分布在细胞质和核仁内。但在染色质及染色体中也含有少量的RNA，核仁中也有少量的DNA。在线粒体，叶绿体等细胞器内除含有RNA外，也含有少量的DNA。一、目的与要求了解Feulgen反应的基本原理，学习其操作方法和压片法，初步掌握细胞分裂各期的主要特点。二、原理Feulgen反应的原理是根据DNA经弱酸（1mol/L）水解后，打开料嘌呤和脱氧核糖连接的键，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。这些醛基就在原位与Schiff试剂结合，形成含醌基的化合物。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠作用形成的无色品红液，当无色品红液与醛基结合则形成紫红色的化合物。醛基是一个发色团所以具有颜色，因此凡有DNA的部位，就呈现紫红色。材料不经过水解或预先用热的三氯乙酸或DNA处理，得到的反应是阴性的，从而证明Feulgen反应的专一性。三、实验内容1、DNA的显示法-Feulgen反应2、压片法3、细胞有丝分裂相的观察四、实验仪器、材料和试剂1、仪器：显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。2、材料：洋葱鳞茎、根尖。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建、试剂：（1）1mol/L盐酸的配制：取82.5ml密度1.19/ml的浓盐酸加蒸馏水至1000ml。（2）Schiff试剂的配制与保存：称取0.5g碱性品红加入到100ml株沸的蒸馏水中，时时震荡，煮5分钟（不能沸腾），使之充分溶解。冷却至50℃时用滤纸过滤，溶液中加入10ml1mol/LHCl，冷却至25℃时加入0.5g偏重亚硫酸钠（Na2S2O5），充分震荡，塞紧瓶塞，室温暗处静置2-3天，颜色褪至淡黄色加入0.5克活性炭用力震荡1分钟，用粗滤纸滤过于棕色瓶（无色无沉淀），密封并外包黑纸，4℃冰箱保存。（3）亚硫酸水：取200ml自来水，加10ml10%偏重亚硫酸钠水溶液和加入10ml1mol/LHCl，三者于用前混匀。五、实验步骤（一）DNA的显示法-Feulgen反应以蚕豆根尖或洋葱根尖为材料,进行Feulgen反应的具体操作程序如下:（步骤1-4可省略）1、切取根尖↓长度0.3-0.5c