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化学诱变技术在微生物育种研究中的应用程 明１，２，崔承彬１，李长伟１，田从魁１，杜智敏２（１．军事医学科学院毒物药物研究所，北京 １００８５０；２．黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨医科大学附属二院临床药物研究所，黑龙江哈尔滨 １５００８６）摘要：化学诱变是一种传统而经典的微生物育种技术，不仅在高产工业菌株选育中得到广泛应用，而且近来还用于改造野生菌株代谢功能，以发现新产活性产物。本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。关键词：微生物育种；化学诱变剂；菌株选育中图分类号：Ｑ９３３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４０４４０（２００９）０６０４１２０６ＣｈｅｍｉｃａｌｍｕｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｐｐｌｉｅｄｉｎｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｂｒｅｅｄｉｎｇＣＨＥＮＧＭｉｎｇ１，２，ＣＵＩＣｈｅｎｇｂｉｎ１，ＬＩＣｈａｎｇｗｅｉ１，ＴＩＡＮＣｏｎｇｋｕｉ１，ＤＵＺｈｉｍｉｎ２（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５０，Ｃｈｉｎａ；２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｏｌｌｅｇｅｉｎＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｙａｎｄＤｒｕｇ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨａｒｂｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００８６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｈｅｍｉｃａｌｍｕｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌａｎｄｃｌａｓｓｉｃａｌｍｕｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｗｈｉｃｈｉｓｕｓｅｄｎｏｔｏｎｌｙｗｉｄｅｌｙｉｎｉｍｐｒｏｖｉｎｇｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓｂｕｔａｌｓｏｒｅｃｅｎｔｌｙｉｎａｌｔｅｒｉｎｇｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅｓｔｒａｉｎｓｔｏｏｂｔａｉｎｂｉｏａｃｔｉｖｅｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｎｅｗｌｙｐｒｏｄｕｃｅｄ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｒｅｖｉｅｗｓｃｈｅｍｉｃａｌｍｕｔａｇｅｎｉｃａｇｅｎｔｓｉｎｒｏｕｔｉｎｅｕｓｅ，ｔｈｅｉｒａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｈｅｍｉｃａｌｍｕｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｐｐｌｉｅｄｉｎｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｂｒｅｅｄｉｎｇ；ｃｈｅｍｉｃａｌｍｕｔａｇｅｎ；ｓｔｒａｉｎｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ 收稿日期：２００９０７１３ 基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．３０５７２２７９，３０９７３６３１）、国家８６３计划（Ｎｏ．２００７ＡＡ０９Ｚ４１１）、国家“重大新药创制”科技重大专项（Ｎｏ．２００９ＺＸ０９１０３０１９，２００９ＺＸ０９３０１００２）、军事医学科学院科研创新基金重大专项（２００８）、中国大洋协会国际海底区域研究开发项目（Ｎｏ．ＤＹＸＭ１１５０２２０９） 作者简介：程 明，男，在读硕士研究生，研究方向：天然药物化学，Ｅｍａｉｌ：ｃｍ９６６７００５０＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：崔承彬，男，教授，博士生导师，研究方向：天然药物化学，Ｔｅｌ：０１０６６９３２６９３，Ｅｍａｉｌ：ｃｕｉｃｂ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ，ｃｕｉｃｂ＠１２６．ｃｏｍ；杜智敏，女，教授，博士生导师，研究方向：临床药理学，Ｔｅｌ：０４５１８６６０５３５３，Ｅｍａｉｌ：ｄｚｍ１９５６＠１２６．ｃｏｍ 菌种优劣对于微生物药物的工业化生产具有决定性意义。野生菌株往往因产率低而不能直接用于工业生产，而需要通过菌种改良，选育高产优良菌株。微生物药物的工业化生产对菌株的这种需求带动了各种育种技术的蓬勃发展，而育种技术则通过不断提供优良菌株又促进了微生物药物产业的持续发展。在育种研究中，近来还发现有些突变株可代谢产生新产物，具有可供作药源新菌株资源的潜在应用前景，使育种技术进一步拓展了新的应用研究发展空间。微生物人工诱变育种技术按诱导突变类型可分为物理诱变、化学诱变和生物诱变三大类［１］。化学诱变是一种传统而经典的微生物育种技术，不仅在高产工业菌株选育中得到广泛应用，而且还用于改造野生菌株的代谢功能，从而发现新产活性产物。在实际应用中，化学诱变既有利用某一种化学诱变剂的单一诱变，也有组合利用化学或其他多种诱变剂的复合诱变，还有化学诱变联合抗生素抗性筛选等。本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。１ 常用化学诱变剂１１ 碱基类似物作为化学诱变剂的碱基类似物主要有嘧啶类似·２１４·ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ ２００９Ｄｅｃ；３６（６）物和嘌呤类似物两大类。其中，常用嘧啶类似物有５溴尿嘧啶（５ＢＵ）、５氟尿嘧啶（５ＦＵ）、６氮杂尿嘧啶（６ＮＵ）等；嘌呤类似物有２氨基嘌呤（２ＡＰ）、６巯基嘌呤（６ＭＰ）、８氮鸟嘌呤（８ＮＧ）等［２］。１２ 烷化剂烷化剂类化学诱变剂种类较多，如硫芥（氮芥）类、环氧衍生物类、乙撑亚胺类、硫酸（磺酸）酯类、重氮烷类、亚硝基类等。其中，亚硝基乙基脲、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸甲酯、甲基磺酸乙酯等较为常用。１３ 移码诱变剂移码诱变剂系指能够引起ＤＮＡ分子中组成遗传密码的碱基发生移位复制，致使遗传密码发生相应碱基位移重组的一类化学诱变物质，主要为吖啶类杂环化合物，常用的有吖啶橙和原黄素两种（图１）。图１ 吖啶橙和原黄素的结构１４ 其他类诱变剂（或协同诱变剂）其他类较常用的还有亚硝酸及其盐和部分金属化合物。２ 化学诱变技术在菌株选育中的应用２１ 单一诱变单一诱变是指在菌株选育中用一种诱变因子致突变的育种实验方法，在化学诱变育种研究中，当仅用一种诱变剂就能达到所需选育目的时，不失为最简便快捷的育种方法。碱基类似物诱变剂是在１９５９年佛里兹提出基因突变的碱基置换理论以后发展起来的。近年单用碱基类似物的诱变育种研究并不多见，文献报道多为组合应用其他诱变剂的复合诱变研究。但程世清［３］采用５ＢＵ单一诱变剂，以１株产类胡萝卜素的分支杆菌为原始菌，分别对菌体及其原生质体进行了单一诱变育种研究。鉴于色素产生与所培养生产菌的细胞量正相关，以单位体积液体培养液中固形物的量（简称生物量）为指标，初步测评了原始菌及其突变株的产色素能力，结果表明，无论从菌体还是从原生质体均得到了产色素能力获得提高的突变株，菌体突变株和原生质体突变株的生物量与原始菌株相比分别平均提高了２２５％和１６４％。自１９４４年奥尔巴克发现氮芥子气的诱变效应以来，烷化剂类诱变剂越来越广泛应用于微生物育种领域。无论是气态的重氮烷还是液态的硫酸二乙酯或固态的亚硝基胍，都能产生较理想的诱变效果，但近年应用较多的是硫酸二乙酯和亚硝基胍。陈新征等［４］以产Ｄ核糖的转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌ＨＧ０２为出发菌，用硫酸二乙酯进行单一诱变，获得了高产突变株ＨＧ０３，其Ｄ核糖产量比原始菌提高了８１７％。与硫酸二乙酯相比，亚硝基胍应用更为广泛。在林肯霉素高产菌株复合诱变选育研究中，以林肯链霉菌９５０２株为出发菌，仅经第１轮亚硝基胍单一诱变处理，所得突变株９５０２７的林肯霉素效价就比出发菌提高了３５４％［５］，而利用亚硝基胍诱变１株Ｌ乳酸产生菌，突变株的乳酸产量超过９０ｇ·Ｌ－１，达原始菌产量的２倍［６］。另外，以丁二酮产生菌Ｘ６７株为出发菌，采用亚硝基胍进行诱变选育，得到高产丁二酮的突变株，其产量比出发菌提高了１２９倍，且遗传性质稳定［７］。在氧化亚铁硫杆菌育种研究中，亚硝基胍诱变使突变株的氧化活性比原始菌提高了４倍［８］。基于Ｆ．Ｈ．Ｃ．克里光等１９６１年提出的移码突变理论，吖啶及其衍生物类凭借对ＤＮＡ遗传密码的移码功能迅即成为移码诱变剂的研究热点。吖啶及其衍生物类可插入到ＤＮＡ分子中，通过复制过程导致遗传密码中碱基移位重组，最终改变突变株的遗传特性［９］。顾真荣等［１０］利用移码诱变剂吖啶橙，通过诱变枯草芽孢杆菌Ｇ３，不仅使突变株培养物的抗真菌活性获得提高，而且还使突变株生物合成伊枯草菌素Ａ的能力得到增强。亚硝酸（盐）作为一种最早被发现的其他类诱变剂在提高产能以及改善微生物有用性能方面有明显作用。当用亚硝酸单一诱变处理氧化铁硫杆菌时，不但菌株氧化活性提高了４１３％，而且对黄铜矿的浸出率提高了１３３％，还使达到浸出终点时间也同时缩短了５～１０ｄ［１１］。在Ｌ组氨酸高产菌株选育研究中，原始菌仅经１轮亚硝酸钠单一诱变，就使突变株的产能比原始菌提高了５０８％［１２］。金属化合物本身通常被认为并无明显诱变作用［２］，但在铁离子摄取调节基因ｆｕｒ有关研究中，曾有报道记载，利用二氯化锰，通过锰诱变成功获得了Ｍｎ２＋抗性ｆｕｒ基因突变株［１３］。本文认为该文所称锰诱变实际上称作二氯化锰抗性筛选可能更为贴切。·３１４·国际药学研究杂志 ２００９年１２月 第３６卷第６期２２ 复合诱变微生物突变机制复杂，单一诱变往往难以达到预期目的。因此，诱变育种往往采用组合２种或者２种以上化学或其他诱变剂的育种方法，即复合诱变法。这种方法可一定程度上克服诱变的盲目性，提高正向诱变效果，因此越来越趋于被大多育种研究所采纳。２２１ 碱基类似物组合其他诱变剂 海藻糖广泛用于食品、化妆品以及医疗卫生领域，国内主要通过酵母菌发酵来生产，因此高产菌株的选育具有重要意义。张丽杰等［１４］以酿酒酵母ＨＹ０１为出发菌，选用２种低毒性化学诱变剂５ＢＵ和盐酸平阳霉素，在确定最佳配比为３００∶５（μｍｏｌ·Ｌ－１）的基础上，通过联用这２种诱变剂进行复合诱变，获得了一定数量的正突变株，其中产能提高最高的１株，发酵物中海藻糖含量达约１６％，比出发菌株提高了１０％。他们还以ＨＹ０１株为出发菌，通过３轮紫外诱变，获得了另１株高产株，海藻糖含量高达１９５％，比出发菌株提高了３５％，表明对ＨＹ０１的复合化学诱变效果不如多轮紫外照射诱变。梁亮等［１２］在Ｌ组氨酸高产菌株选育研究中，通过组合使用６ＭＰ平板筛选与紫外亚硝酸钠复合诱变，筛选获得了高产菌株。２２２ 烷化剂组合其他诱变剂 在１，３丙二醇产生菌诱变育种研究中，李凤梅等［１５］以丁酸梭菌２０９株为原始出发菌，经２轮硫酸二乙酯诱变，得到了１，３丙二醇产量提高１１３％的突变株。在此基础上再经１轮紫外诱变和１轮紫外与亚硝基胍组合诱变，获得了产能进一步提高的突变株，其１，３丙二醇产量达１５７ｇ·Ｌ－１，与原始出发菌（产量２２ｇ·Ｌ－１）相比，提高了６１３倍。硫酸二乙酯还用于纤维素酶高产菌株选育研究中。兰时乐等［１６］以绿色木霉为原始出发菌，通过微波、硫酸二乙酯、氯化锂依次组合３轮筛选，获得了纤维素酶高产突变株，与原始出发菌相比，该突变株的羧甲基纤维素酶活力、滤纸酶活力和棉花糖酶活力分别提高了１０７％、１５２４％和１４０５％。亚硝基胍组合其他诱变剂的复合诱变研究更为多见。李戈等［１７］以链霉菌ＬＡ５株为原始出发菌，采用紫外、微波、亚硝基胍、紫外＋亚硝基胍、亚硝基胍＋紫外等诱变方式，选用其中效果好的复合诱变方法，经对ＬＡ５的４轮亚硝基胍＋紫外双因子组合复合诱变，筛选得到了１株高产抗生素的突变株，其产能以发酵液抑菌活性为指标比原始出发菌ＬＡ５提高了３４５％。在头孢菌素Ｃ产生菌的菌株改良研究中，Ｅｌｌａｉａｈ等［１８］通过紫外和亚硝基胍复合诱变也得到１株头孢菌素Ｃ产量比原始菌提高２４倍的高产突变株。李淑彬等［１９］以抗真菌抗生素土曲霉酸（ｔｅｒｒｅｉｃａｃｉｄ）产生菌黄柄曲霉１７９株为原始出发菌，组合利用亚硝基胍、紫外等诱变剂和自产抗生素土曲霉酸，通过人工诱变与自产抗生素抗性筛选相结合的多轮复合诱变进行了高产菌株的选育研究。以抗菌活性为指标，通过对原始