搜索
1生物工程专业《生化技术》课程实习指导书张如新、任光云编著邵阳学院生物与化学工程系2012年10月2目录实习项目一、超临界CO2萃取山茱萸中有效成分熊果酸………………1实习项目二、加携带剂超临界CO2萃取山茱萸有效成分熊果酸………5实习项目三、HPLC法测定萃取物中有效成分熊果酸的含量…………71实习项目一、山茱萸有效成分熊果酸的超临界CO2萃取一、实验目的与要求1、掌握超临界CO2萃取的原理2、掌握超临界CO2萃取的操作3、掌握材料的处理与准备二、原理超临界CO2萃取是利用欲分离物质与杂质在超临界CO2中溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。超临界流体兼有气、液两者的特点，密度接近于液体，粘度和扩散系数接近于气体，它不仅具有与液体溶剂相当的溶解能力，而且具有优良的传质性能。超临界流体CO2萃取技术就是利用这种超临界流体的特殊性质，在高压条件下与待分离的固体或液体混合物接触，有效成分能溶解在超临界流体CO2，通过调节系统的操作压力和温度，可萃取所需要的物质。随后通过降压或升温的方法，降低超临界流体CO2的密度，使萃取物溶解度降低，使目的物与超临界流体分离，萃取得到有效成分即目的物。三、材料与仪器1、材料：山茱萸2、CO2气体3、仪器：超临界CO2萃取装置4、植物样本粉碎机四、操作步骤1、材料的准备选择优质的山茱萸材料，把其中的杂质去掉，称取1公斤山茱萸在70~100ºC烤箱中烘烤3~4小时至完全干燥为止。用粉碎机粉碎（过40目筛），粗粉要再次粉碎，直到能过40目筛。2、萃取称取100g粉碎的山茱萸装入萃取缸并把萃取缸安装好，在压力为30MPa、温度为40ºC下萃取3~4小时。并按CO2超临界萃取装置使用说明书（见附页）开机进行萃取操作：（注意：一定要在熟练掌握原理和操作规则情况下才正式开机操作。）3、收集萃取物2在收集萃取物之前，应准备4个洗干净并烘干的250ml锥形瓶。每萃取1个小时收集一次，具体操作按说明书。最后收集完后，用封口膜封好锥形瓶，贴好标签并标好组号，时间等。保存好以备后面实验。4、记录应认真记好实验数据，包括实验的条件（如萃取温度、压力、萃取时间等），实验结果和实验现象等。5、仪器清理做完实验后，应依次用自来水，蒸馏水和无水乙醇清洗萃取缸和分离缸。清理打扫实验现场，包括实验台卫生，实验室卫生。特别提醒注意关掉萃取装置总电源。附页CO2超临界萃取装置使用说明书CO2夹带剂冷箱制冷循环系统流量计主泵副泵混合器预热器压力表放空压力表放空压力表萃取缸分离1分离2加热1加热2加热3精馏柱图1CO2超临界萃取流程图12345678912151014131116181720193第一步：放空（关V28）关V28、V25及V11，打开V24（可同时打开萃取缸下的开关V8）把萃取缸中的CO2放干净，至萃取压力为零。如果不放空萃取缸取不下来，没放空CO2取下萃取缸很危险。关掉V25和V11时分离缸Ⅰ和分离缸Ⅱ不需放空。如需放空分离缸Ⅰ和分离缸Ⅱ，则不要关V25和V11，也可同时打开分离缸Ⅰ和分离缸Ⅱ下面的开关。第二步装料当萃取缸压力为零时，取下萃取缸，称取一定量的粉碎样品装入萃取缸，再按要求装好萃取缸，一定要拧紧螺栓。第三步萃取1、开电源2、开钢瓶（开到底再倒拧一圈）3、打开V1和V284、开总电源，至三相电源指示灯全亮5、开冷循环、制冷开关。6、开萃取、分离Ⅰ和分离Ⅱ开关，并调节设定温度。7、当温度达到设定温度后，开主泵开关，有显示后开RUN开关，主泵运转。开V25调节压力至设定压力并稳定此压力，开V11调节压力至8MPa。8、当压力平衡后，关V1（CO2在装置内反复循环，）如果压力过大，超过设定的安全压力时，主泵开关自动停止，此时需再次打开主泵开关，调节压力。9、萃取开始，并记录时间，萃取一定时间后，定时取样。10、取样时，开关稍打开，不能打开太大，边开边关。一次萃取完时，若继续萃取，应先关主泵开关，打开V1、V25、V11。让CO2回流至钢瓶，并使各部分压力平衡，即萃取缸压力=分离Ⅰ=分离Ⅱ=贮罐压力。11、关V1、V25、V28后，使萃取缸放空，开V8让萃取缸放空，也可以放V24让萃取缸放空。第四步携（夹）带剂萃取1、关V1，量取一定的携带剂加入后面的携带剂罐中。2、打开V7和副泵开关。再打开后面的副泵放气阀，排除携带剂计量器与副泵之间4的气体，至有携带剂流出时为止，关副泵放气阀。3、等携带剂注完后，关副泵和V7。第五步关机关掉V1、V25和V28，开V24放空，再关主泵开关、制冷开关、冷循环开关、总开关和钢瓶开关。5实习项目二、加携带剂超临界CO2萃取山茱萸有效成分熊果酸一、目的与要求1、掌握CO2超临界萃取原理与操作2、掌握携带剂对萃取结果的影响3、掌握加携带剂CO2超临界萃取的操作二、原理超临界CO2萃取是利用欲分离物质与杂质在超临界CO2中溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。超临界流体兼有气、液两者的特点，密度接近于液体，粘度和扩散系数接近于气体，它不仅具有与液体溶剂相当的溶解能力，而且具有优良的传质性能。超临界流体CO2萃取技术就是利用这种超临界流体的特殊性质，在高压条件下与待分离的固体或液体混合物接触，有效成分能溶解在超临界流体CO2中，通过调节系统的操作压力和温度，可萃取所需要的物质。随后通过降压或升温的方法，降低超临界流体CO2的密度，使萃取物溶解度降低，使目的物与超临界流体分离，萃取得到有效成分（即目的物）。携带剂是在超临界萃取过程中为了提高分离效果，在超临界流体中添加少量的另一种溶剂（如水、乙醇、丙酮等）。使用携带剂对结果有明显的影响。通常因加入携带剂可显著提高超临界萃取的分离效果。不同携带剂对有效成分的萃取影响不同。通过实验可以找出有效成分的最佳的携带剂。三、材料、仪器与试剂1、材料：山茱萸2、仪器：超临界CO2萃取装置、植物样本粉碎机3．试剂：乙醇四、操作步骤（见说明书）1、材料的准备选择好山茱萸材料，把其中的杂质去掉，称取1公斤山茱萸在70~1000C烤箱中烘烤3~4小时至完全干燥为止。用粉碎机粉碎（过40目筛），粗粉要再次粉碎，直到能过40目筛。2、加携带剂萃取称取100g粉碎的山茱萸装入萃取缸并把萃取缸安装好，在压力为30MPa、温度为6400C下、按说明书操作加入100ml无水乙醇携带剂。并按CO2超临界萃取装置使用说明书（见附页）开机进行萃取操作，萃取3~4小时。（注意：一定要在熟练掌握原理和操作规则情况下才正式开机操作。）3、收集萃取物在收集萃取物之前，应准备4个洗干净并烘干的250ml锥形瓶。每萃取1个小时收集一次，具体操作按说明书。最后收集完后，用封口膜封好锥形瓶，贴好标签并标好组号，时间等。要保存好以备后面实验。4、记录应认真记好实验数据，包括实验的条件（如萃取温度、压力、萃取时间和加入携带剂的种类和数量等），实验结果和实验现象等。5、仪器清理做完实验后，应依次用自来水，蒸馏水和无水乙醇清洗萃取缸和分离缸。清理打扫实验现场，包括实验台卫生，实验室卫生。特别提醒注意关掉萃取装置总电源。7实习项目三、HPLC法测定萃取物中有效成分熊果酸的含量一、实验目的1、掌握高效液相色谱（HPLC）的原理和操作2、掌握用高效液相色谱定性和定量分析有效成分二、原理高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)又称高速或高压液相色谱。该方法是吸收了普通液相层析和气相色谱的优点，经过适当改进发展起来的。它既有普通液相层析的功能(可在常温下分离制备水溶性物质)，又有气相色谱的特点(即高温、高速、高分辨率和高灵敏度)；它不仅适用于很多不易挥发、热分解难的物质(如金属离子、蛋白质、肽类、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、单糖、寡糖和激素等)的定性和定量分析，而且也适用于上述物质的制备和分离。高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与其相对应的普通液相层析相似。其不同之处首先是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且需在色谱仪中进行；其次是样品液和流动相溶液在进入色谱柱前，必须超滤处理，这样可提高色谱柱的使用寿命。HPLC的构造如下：（一）、进样系统采用隔膜注射进样器或高压进样阀完成进样操作，进样量是恒定的，在分析操作中通常进样量是20µl。（二）、输液系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。（三）、分离系统该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱是核心部分，其大小是根据使用目的、样品数量及其复杂程度决定的。色谱柱长度一般为5～70cm，直径为1～50mm，通常分析型色谱柱的体积比制备型的小，并偏向细而长，而制备型色谱柱的体积大，直径也较大。在HPLC中的色谱柱是由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5～10µm(分析型)或数十微米(制备型)粒度的固定相。固定相中的基质是由机8械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性(如硅胶表面的硅醇基团基本已除去)、多孔性(孔径可达1000Ả)和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样)，或者用化学法偶联各种基团(如磺酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。另外，固定相基质粒度小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论(即塔板理论数N与理论塔板高度H成反比，而理论塔板高度H与颗粒度的平方成正比)分析，基质粒度越小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。（四）、检测系统高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器、荧光检测器三种。（五）、数据处理系统该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。三、操作1、标准样器的配制用电子天平精确称取熊果酸标准样品1.5mg置于2mlEP管中，用移液器精确量取1ml无水甲醇（色谱纯）加入EP管中，使熊果酸充分溶解于甲醇中，即得1.5mg/ml的标准液。2、样品的制备将前面得到的超临界CO2萃取物分别先用色谱纯甲醇充分溶解，再定容至50ml、过滤，取滤液2ml置于2ml离心管中，离心5min（10000r/min），取上清液放于2ml离心管中用于HPLC定性定量分析。3、上样层析色谱条件：色谱柱YWG-C18（250mm×4.5mm,10µm）流动相：甲醇，流速：1.0ml/min;紫外检测器波长215nm；柱压：0～30Mpa;进样量20µl；柱温，室温。准备好HPLC装置，分别用标样和样品层析，采集数据，并打印好色谱图。4、计算用面积归一法通过标准样品峰面积和含量与样品峰面积与含量的关系算出样品的含量。