北京大学医学部生物物理学系

Techniquesinreceptorresearch尹长城北京大学医学部生物物理学系参考资料参考书受体研究技术贺师鹏胡雅儿夏宗勤主编北京大学医学出版社2004实验室网页受体概论1.1受体概念的形成与发展1.1.1受体概念的发展历史100多年前，J.N.Langley发现箭毒能明显对抗烟碱的收缩效应指出药物可能和细胞中某种特异成分结合而发挥作用，当箭毒与这种接受物质结合就阻断了烟碱的作用他称这种特异成分为接受物质(receptivesubstance)1.1受体概念的形成与发展1.1.1受体概念的发展历史P.Ehrlich认为细胞上有许多侧链，当细胞上的侧链基团和毒素分子的基团结构上互补形成类似钥匙和锁的关系，两个基团可相互结合P.Ehrlich将细胞上的这些侧链称之为受体(receptor)根据受体理论，研究不同类型化学物质对锥虫的作用，提出了化学受体(chemoreceptor)的概念1.1受体概念的形成与发展1.1.1受体概念的发展历史20世纪20年代末，A.J.Clark提出了“占领理论”(occupancytheory)生物活性通过“占领”受体结合位点而起作用，生物活性物质与其特异性受体之间的反应是一个可逆的处于动态平衡的过程，符合质量作用定律提出了生物活性物质与相应受体亲和力的概念提出了药物产生的效应与受体的结合量呈正比关系的概念缺陷：不能解释不同药物作用于同一类受体会诱发不同的反应1.1受体概念的形成与发展1.1.1受体概念的发展历史1954年，E.J.Ariens提出内在活性(intrinsicactivity)的概念活性物质所产生的最大效应取决于分子本身的性质完全激动剂部分激动剂完全拮抗剂1956年，R.P.Stephenson提出药物效能(efficacy)的概念一种物质与受体结合所产生的效应取决于该物质的效能而不取决于占领受体的量1961年，W.D.M.Paton提出速率理论(ratetheory)配基与受体相互作用，所引起的效应与其占领受体的速率成正比1.1受体概念的形成与发展1.1.1受体概念的发展历史直到20世纪60年代前受体还基本上是一个理论上的概念受体是什么物质？位于细胞的什么部位？如何发挥作用？1.1受体概念的形成与发展1.1.1受体概念的发展历史20世纪60年代，受体研究进入新的阶段首先，放射性同位素技术开始用于受体的研究，建立了放射性配基结合分析法(radioligandbindingassay，RBA)使人们能够在实际上接触到受体分子，为受体亲和力与受体数量的定量研究提供了可靠和灵敏的方法可以对受体分子进行纯化，从而了解到受体分子都是有特定结构的蛋白质分子；为从分子水平上研究配基与受体的相互作用打下了基础RBA的出现大大推进了受体的研究，具有划时代的意义1.1受体概念的形成与发展1.1.1受体概念的发展历史其次，20世纪70年代Sutherland发现环核苷酸(cAMP或cGMP)在激素与细胞反应的效应之间充当信使作用，从而提出第二信使学说阐明了神经递质和激素作用于受体，引发信号转导机制并引起细胞功能的变化1.1受体概念的形成与发展1.1.1受体概念的发展历史第三，分子生物学技术推动了受体研究通过DNA分子克隆技术阐明受体蛋白质的一级结构通过基因同源性的研究找到很多过去用其它方法难于发现的受体或受体的新亚型为研究受体结构和功能的关系提供了必不可少的前提1.1受体概念的形成与发展1.1.1受体概念的发展历史第四，结构生物学的发展推动了受体研究通过结构生物学获得受体蛋白的三维结构信息阐明受体-配体相互作用的本质阐明受体疾病的分子机理辅助受体药物的设计1.1.2受体的现代概念受体是存在于细胞表面或细胞内的，具有特异识别和结合细胞内外某些特定化学信号物质的蛋白质分子化学信号物质(通常也称配基)可以是激素、神经递质、细胞因子和生长因子、某些药物等配基与受体结合，使受体激活并产生信号转导，启动细胞内相应的生物效应受体研究的内容不仅仅限于受体与配基的相互作用，而且还包括受体的激活机制，受体激活后如何启动后续信号转导机制，信号转导的具体途径，以及如何引起相应的生物学效应等等1.2受体与配基结合反应的基本特性1.饱和性对某种特定的细胞来说，每种特定的受体，其数量有一定限度因此，配基与受体结合的反应具有饱和性当配基浓度逐步增加，它和受体的特异结合也会逐步增加，但是当升高到一定浓度，会使绝大多数受体都被配基结合，再增加浓度，复合物的升高就很有限，表现出受体被饱和的现象。特异的受体结合反应其受体呈高亲和性和低容量，非特异结合则呈低亲和性和高容量1.2受体与配基结合反应的基本特性2.可逆性内源性配基和特异受体的结合反应属于可逆反应当周围的配基浓度降低时，形成的复合物就会解离，重新变成游离的配基和受体这种可逆性是受体对周围环境变化快速和正确反应的基础外源性配基则有两类不同的情况很多外源性配基和受体的结合也是可逆反应，解离后的配基是原形另有一类不可逆阻断剂与受体形成的复合物是不可逆的，最终导致受体分子的破坏和配基的代谢变化1.2受体与配基结合反应的基本特性3.特异性受体具有特异识别配基的性能，特定的受体只识别特定的配基受体识别配基的基础是受体某个部位的立体结构，即受体蛋白的构象各种受体的识别能力是不同的，受体识别能力强，受体特异性就好受体的识别还和配基的构型和构象有关,只有存在严格构型和构象的配基分子才能选择性地与其受体结合受体的特异性还表现在器官或组织的专一性（称靶器官），如子宫、阴道、乳腺等器官对雌激素敏感，因为这些器官上雌激素体受体的数量明显高于非靶器官1.2受体与配基结合反应的基本特性受体的亲和力受体和配基的结合能力，受体亲和力高说明受体和配基容易结合而不容易解离受体亲和力的定量指标是受体的解离平衡常数Kd(亲和常数Ka的倒数)，Kd越大则亲和力越小受体的Kd值一般在10-8-10-12mol／L之间。Kd值小于10-9mol/L的通常称为高亲和力受体的亲和力和配基种类有关，评价Kd值的绝对值大小必须指明配基的种类1.2受体与配基结合反应的基本特性4.生物效应的相关性受体的主要功能是介导配基的生物学效应，如果一种蛋白能与某种物质相结合而并不介导特定的生物学效应，那么这种蛋白不能称之为受体生物效应和受体结合反应需有两方面的匹配:一是浓度上的匹配，二是组织分布的匹配如果某种化合物与某种受体有结合，但该化合物的结合浓度明显不同于它引起生物效应的浓度，或者它引起生物效应的组织和它结合的组织不一致，那么这种化合物和受体的结合是否属于特异结合就有疑问1.3受体与配基相互作用1.3.1受体和配基的相互作用力和结合能受体与配基的相互作用的本质为物理化学过程作用力源自于带电荷基团间的静电作用或者非极性分子间的吸引作用配基与受体的相互作用既然是一种物理化学过程，必然有成键过程，一定有能量释放1.3受体与配基相互作用根据Hammett方程R是气体常数,T是绝对温度,Ka是结合平衡常数G°是成键时释放的自由能，其值与Ka的对数成正比，所以Ka值是评估成键作用能力的物理量,是受体和配基的结合能力的物理量aoKRTGln化学键类型与自由能的关系化学键类型G°(KJmol-1)共价键-(170~420)离子键-(21~42)偶极键-(4~29)氢键-(4~29)疏水键-4范特华力-(2~4)1.3受体与配基相互作用实验证据表明，配体与受体相互作用是可逆反应它们之间的作用力是属于较弱的次级键静电作用氢键范德华力疏水键等1.3受体与配基相互作用1.静电作用静电作用是指荷电基团、偶极以及诱导偶极之间的静电吸引力静电作用包括离子键、离子-偶极相互作用和偶极-偶极相互作用等三个方面受体蛋白质的表面都有可电离的基团和偶极基团，受体蛋白质的活性中心大都有极性区域，易与含极性基团的配基生成离子键和其他静电作用就药物而言，它和受体的最初作用通常是由于受体的活性中心极性基团对它的吸引所引起。许多药理效应的关键作用步骤要求通过电荷中心的作用来实现离子键在生理条件下，一些氨基酸如精氨酸、赖氨酸可以形成正离子含有这些氨基酸的蛋白质受体在体内就可形成阳离子,可以与电性相反的配基或药物分子以离子键形式相结合这种离子键可以解离，因此离子间的吸引力是可逆结合离子键作用力大小可用库仑定律表示式中q1、q2为离子的电量，r为两个离子间的距离，为介质的介电常数，r0为单位矢量相互作用能为0221rFrqqrqqdrqqdU210221rrrF离子—偶极相互作用配基或药物分子和受体分子中O、S、N或C原子的电负性均不相等这些原子形成的键由于电负性的差值可以产生偶极现象。这种偶极部分与持久电荷可以形成静电作用离子—偶极相互作用相互作用能由下式表示式中为偶极矩，θ为偶极方向与电荷至偶极中心连线的夹角，q为电荷电量，为介电常数，r为电荷与偶极中心的距离。离子—偶极相互作用比离子键小得多，键能与距离的平方成反比。由于偶极矩是个向量，电荷与偶极的取向会影响药物—受体的作用强度，随方向的变化而变化。2cosrqU偶极—偶极相互作用两个原子的电负性不同，产生价键电子的极化作用，成为持久的偶极两个偶极间的作用能由下式表示式中x为偶极矩，为介电常数，r为偶极中心的距离]))((3[123rrUrμrμμμBABA偶极—偶极相互作用偶极—偶极相互作用的大小，取决于偶极的大小、它们之间的距离和相互位置偶极—偶极相互作用非常普遍，常发生在水溶液中。水分子是偶极分子，它可与带有羰基或杂原子的药物作用药物也可与蛋白质受体等生物大分子的极性基团作用偶极-偶极作用对配基—受体相互作用的特异性和立体选择性非常重要2.氢键氢键的形成:氢键是由两个负电性原子(N,O,S等)对氢原子的静电引力所形成，是一种特殊的偶极-偶极键它是质子给予体X-H和质子接受体Y之间一种特殊类型的相互作用，是H原子和电负性很强的杂原子之间作用的键，即X-H···YR在氢键中，最常见的质子给予体有OH、NH，而SH是很弱的质子给予体。质子接受体均有未成键的p电子或π电子，通常有OH、OR、NH2、N（芳香氮）、NH-R、卤素、SR、C=C、C=N等氢键在生物体系中，基本溶剂水以及蛋白质、核酸等都含有大量能形成氢键的基团药物进入生物体系以及构成特殊状态与受体分子间相互作用的过程中，氢键对分子的取向有非常重要的作用最常见的氢键在羟基和胺基之间形成生物体系中超分子的自组装离不开氢键的参与，如DNA分子中的A:T及G:C残基间的氢键作用氢键氢键的大小及方向:氢键的大小通常由氢键的键能来描述，它是指发生下列过程所需要的能量X-HYR→X-H+Y-R氢键的键能比共价键弱，比范德华力强，在生物体系中通常为8.4~33.4kJ/mol(2~8kcal/mol)。键长为0.25~0.32nm氢键氢键的方向用键角来表示，是指X-H与HY之间的夹角，一般为180°~125°最强的氢键是X、H、Y均在一条直线上，即键角为180°非直线型氢键比直线型弱，一般只有8.4kJ/mol（2kcal/mol）左右，比水分子氢键的特征值20.9kJ/mol(5kcal/mol)弱得多，但许多这样的弱作用的合力是很大的，对稳定生物大分子的高级结构起重要作用氢键的分类按氢键强弱进行分类。这种方法依据谱波学和晶体结构数据进行分类分类OH(cm-1)r(OH)(nm)实例弱氢键32000.270H2O(冰、水合物）R-OH(醇、酚)中强氢键2800~31000.260~0.270R-COOH(羧酸)强氢键700~27000.240~0.