《宁波市鹌鹑禽流感抗体滴度监测》实验内容

《宁波市鹌鹑禽流感抗体滴度监测》实验内容1材料与方法1.1材料和仪器禽流感病毒液、阳性血清（青岛市红岛镇中国动物卫生与流行病学中心提供）、1%鸡红细胞（自配）、生理盐水（自配）、阿氏（Alsevers）液（自配），96孔V形微量反应板，50微升定量液移管，滴头。微量振荡器（江苏省金坛市宏华仪器厂）1.2实验方法1.2.1取材从不同年龄的鹌鹑中翅静脉采血，放置于洁净的瓶中，置于4℃冰箱过夜，用吸管吸取上清血清，置于离心管中1000r/min5min，吸取上清血清，用PBS液稀释备检。1.2.2血凝（HA）试验（微量法）（1）在微量反应板的1-12孔均加入0.025mLPBS，换滴头。（2）吸取0.025mL抗原加入第l孔，混匀。（3）从第1孔吸取0.025mL抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。（4）每孔再加入0.025mLPBS。（5）每孔均加入0.025mL1%（V/V）鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。（6）振荡混匀，在室温（20℃-25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下1hr）。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。（7）结果判定。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。1.2.3血凝抑制（HI）试验（微量法）（1）根据血凝试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。（2）在微量反应板的1-11孔加入0.025mLPBS，第12孔加入0.05mLPBS。（3）吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。（4）1-11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20℃）静置至少30min。（5）每孔加入0.025mL的鸡红细胞悬液轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下1hr），对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底。2.1结果与讨论2.1.1结果以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于31og2判定HI试验阴性；HI价等于41og2为阳性。2.1.2讨论2.1.2.1微量血凝试验的常见问题（1）抗原效价和血清抗体滴度发生偏差而产生实验误差。（2）凝集板出现跳孔现象。（3）凝集不明显，无法判定结果。2.1.2.2问题的原因及应对措施（1）被检血清腐败变性。血样采集后要及时分离血清，分离后即时测定或放置在4℃冰箱内保存，不可过久，要力求新鲜。（2）缓冲液配制时间过长，PH值发生变化，使凝集不明显。缓冲液（PBS）尽可能现配现用，浓度和酸碱度要准确，可用HCL和NAOH液调节酸碱度，并用PH试纸进行测试到PH值合适为止。如果用生理盐水代替缓冲液，要使用新生产、新开瓶的生理盐水。（3）病毒悬液和红细胞悬液在使用前没有摇匀，加入时浓度高低不一，人为造成误差。因此抗原和红细胞使用前一定要摇匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致。（4）红细胞的敏感性降低。配制红细胞悬液应采集2只以上成年公鸡的血，一般要求用非免疫公鸡，如果用免疫公鸡代替，但应增加洗涤次数和时间，在洗涤红细胞时要去除表面的白细胞膜否则将影响红细胞的敏感性。（5）在使用微量移液器时，液体加入量发生误差。在使用微量移液器时，每个吸头要安装牢固，防止漏气；操作时手压下的力度要均匀，否则移液量就不准，造成结果不准确。移液管嘴浸入液面下的深度要力求一致，不可过深，移液器管嘴插入较深，留在管嘴外的液体也滴入孔内，吸取量增大，对抗体滴度发生影响。如果插入过深时，待管嘴撤出液面后斜贴在容器壁上，淌走多余的液体再滴加入凝集板孔中。（6）在稀释血清时，产生气泡。倍比稀释血清时，在吸取第一孔时要先按下移液器，再插入凝集板孔，吸取后加入第二孔，在反复抽取过程中，移液器滴头不要离开液面，防止产生气泡，造成移液量不准。（7）在使用移液器滴加液体时，有时会将管嘴与凝集板孔相接触，造成污染。尤其是在加入红细胞悬液时，孔内已有稀释液、抗原、血清等，如果管嘴接触到孔内混合液，会造成各个孔内液体相互污染。所以在使用移液器时，一定要保持加样器管嘴与凝集板孔间的距离，以保证每个凝集孔内液体数量和浓度准确。（8）在凝集过程中振动凝集板。有些操作者在实验过程中，急于想知道结果，将凝集板随时取放，使凝集受到影响。因此在静置过程中一定要有耐心，不要急于求成，等时间到时再看结果，才能保证实验的准确性。（9）凝集板不干净。微量血凝板的清洗，对试验结果有很大的影响。尤其是使用过的凝集板，要按程序清洗干净。一般的清洗程序是：试验完毕后，立即将凝集板用自来水反复冲洗，再用洗涤剂的温水溶液浸泡30分钟，并在洗涤剂溶液中以棉拭子刷洗凹孔及板面，待反应板干燥后，放到2—3%浓度的盐酸中浸泡24小时以上，捞出用自来水冲洗多次，最后以蒸馏水冲洗2—3次，在37度温箱中烘干备用。如果使用的是一次性凝集板，要保持板面及凹孔的干净。总之，在实验中，一定要细致耐心，严格按程序操作，发现问题及时纠正处理，这样才会获得满意的实验结果。1．阿氏（Alsevers）液配制葡萄糖2.05g柠檬酸钠0.8g柠檬酸0.055g氯化钠0.42g加蒸馏水至100mL，加热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。2．1%鸡红细胞悬液制备采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH7.2的0.01mol/LPBS液洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成1%（V/V）红细胞悬液，4℃保存备用。3．pH7.2的0.01mol/LPBS的配制（1）配制25×PB：称量2.74g磷酸氢二钠和0.79g二水磷酸二氢钠加蒸馏水至100mL。（2）配制1×PBS：量取40mL25×PB，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1000mL。（3）用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2。（4）灭菌或过滤。（5）PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。