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动物产品中微生物检测技术王娟中国动物卫生与流行病学中心2009-3-11内容沙门氏菌金黄色葡萄球菌O157︰H7单核增生性李斯特氏菌存在问题沙门氏菌DANIELELMERSALMON,(1850-1914)美国兽医微生物和病理学家。是美国授予的第一位兽医学博士。1884年任美国农业部畜牧局首任局长。他首次从病猪中分离出猪霍乱沙门氏菌。在医学微生物中通用的沙门菌一词，就是为纪念他而以他的名字命名的。沙门氏菌（Salmonella）沙门菌（Salmonella）沙门菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门杆菌。大小0.6～1.0×2～3um，无芽胞，一般有鞭毛(鸡沙门菌除外)，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为35～37℃，最适pH值为6.8～7.8。沙门氏菌生物学性状不分解乳糖（亚利桑那菌除外）。分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。多数产生H2S，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。沙门菌生物学性状国内外沙门菌检测方法（传统方法）国家标准GB/T4789.4-2003行业标准FDA（Food&DrugAdministration）AOAC(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)FSIS（FOODSAFETYANDINSPECTIONSERVICE）ISO加拿大官方食品微生物分析方法冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品前增菌法25g＋BPW225mL36℃±1℃一般4h，干蛋品18h～24h10mL＋MM（或TTB）100mL10mL＋SC100mL直接增菌法25g＋灭菌生理盐水25mL检样匀液25mL＋MM（或TTB）100mL检样匀液25mL＋SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/AH2S－结果），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸沙门氏菌血清学试验甘露醇山梨醇H2S＋靛＋尿－KCN－赖＋H2S－靛－尿－KCN－赖＋/－非如左述的各种反应结果沙门氏菌血清学试验ONPG－沙门氏菌非沙门氏菌42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃40h～48h36℃±1℃18h～24h微生物学检验沙门氏菌检验中华人民共和国国家标准GB/T4789.4-2003出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法肉类、蛋品缓冲胨水（BPW）四硫磺酸盐煌绿（TTB）亚硒酸盐胱氨酸（SC）37℃4hor20～24h直接选择性增菌亚硒酸盐胱氨酸（SC）四硫磺酸盐煌绿（TTB）37℃24±2hBS&DHL(亚利桑那菌琼脂)前增菌37℃24～48hTSI&赖氨酸脱羧酶TSI&尿素酶37℃24～48h生化试验血清学试验（“O”抗原，“Vi”抗原）42℃20±2h37℃24～48h结果判定检验检疫行业标准SN0170－92样品25g225mL乳糖肉汤（LB）or胰酪胨大豆肉汤（TSB）or煌绿溶液（BG）or通用前增菌肉汤（UPB）or营养肉汤（NB）or再造脱脂奶粉or四硫酸盐煌绿（TT）pH6.8±0.224±2h35℃RVTT43±0.2℃or35±2.0℃24±2h24±2h42±0.2℃BS&XLD&HE24±2h35℃TSI&LIA非沙门菌沙门菌非沙门菌LIA+LIA－TSIK/ALIA－TSIA/A&尿素酶，H抗原（多价H抗血清或Spicer-Edwardsflagellar(H)test），赖氨酸脱羧酶，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐5种商业生化鉴定系统（API20E,EnterotubeII,EnterobacteriaceaeII,MICRO-ID,orVitekGNI）&O抗原&H抗原细菌学分析手册（FDA/BAM）第五章沙门氏菌属肉、禽和蛋品中沙门菌的分离和鉴定USDA/FSISMLG4.02样品BPWorBPW（含结晶紫）35±1℃20-24hBGS&DMLIAorXLT442±0.5℃22~24h0.5±0.05mL＋10mLTT0.1±0.02mL＋10mLmRV42±0.5℃22~24h35±1℃18~24h&48hTSI&LIA血清学试验商业生化试剂盒或自动鉴定系统or传统生化鉴定（AOACOfficialMethod967.27orEdwardsandEwing'sIdentificationofEnterobacteriaceae）报告结果肉制品中沙门菌的分离和鉴定FDA&USDA/FSIS乳糖肉汤缓冲蛋白胨水TTB肉汤RV肉汤TTB肉汤RV肉汤BSXLDHEXLT42倍改良LIABGS生化筛选（LIA,TSI）鉴定及确证试验葡萄糖脲酶试验卫矛醇动力试验吲哚MR-VP测试氰化钾粉红酒石酸盐琼脂乳糖水杨苷赖氨酸脱羧酶西蒙氏枸橼酸盐丙二酸蔗糖血清学试验AOAC沙门菌检测方法AOACOfficialMethod967.25SalmonellainFoodsPreparationofCultureMediaandReagentsAOACOfficialMethod967.26SalmonellainProcessedFoodsDetectionAOACOfficialMethod967.27SalmonellainFoodsIdentificationAOACOfficialMethod967.28SalmonellainFoodsSerologicalTests食品中的沙门菌检测方法AOAC967.25－967.28处理样品1mL+10mLSC1mL+10mLTT35℃24±2hXLD&HE&BS35℃24±2h（BS24h&48h）35℃24±2hTSI&LIA35℃24±2h纯培养物不纯培养物纯培养物MACorXLDorHE尿素酶－尿素酶＋非沙门菌H抗原，LIA，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原吲哚＋&H血清－KCN＋&LIA－非沙门菌非沙门菌补充生化试验酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐非沙门菌沙门菌25g样品225mLBPW35℃or37℃16~20h0.1mL+10mLRV10mL+100mLSC42℃24h35℃or37℃24h&48h酚红煌绿琼脂（亮绿琼脂）&第二种选择性平板35℃or37℃20~24h无典型菌落再培养18～24h典型菌落（pinkred）营养琼脂纯化可疑菌落每个平板选5个菌落35℃or37℃18~24hTSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPG，VP，吲哚血清学试验（O抗原，Vi抗原，H抗原）报告结果送参考实验室ISO6579:1993(E)微生物－沙门菌检测的通用方法25g样品营养肉汤or缓冲胨水or煌绿水溶液or胰蛋白酶大豆肉汤35℃18~24h1mL+9mLSC1mL+9mLTBG35℃24±2h42.5℃24±2hBS&BGS35℃24±2h&48±2h纯培养物不纯培养物纯培养物MACTSI&LIA&尿素琼脂O多价血清，H多价血清食品中沙门菌的分离和鉴定加拿大HPB方法商业生化试剂盒或自动鉴定系统报告MFHPB-20判断标准国标、无公害食品标准、绿色食品标准：沙门氏菌不得检出（未检出/25g）。美国标准中规定：沙门氏菌最大检出数——小公牛/小母牛：1/82；母牛/公牛：2/58；碎牛肉5/53；嫩鸡12/51；猪6/55；碎火鸡肉29/53；碎鸡肉26/53。沙门氏菌的危害据美国疾病控制中心报告，沙门氏菌是美国食物中毒致死的主要原因，每年全国大约报告40000例沙门氏菌感染病例，据不完全统计，每年大约有1000人死于急性沙门氏菌感染。日本厚生省统计，在发生的670起细菌性食物中毒中，沙门氏菌占62起，排在第三位，中毒人数为2045人。有些国家，沙门氏菌食物中毒占细菌性食物中毒的40%-60%以上。我国以沙门氏菌引起的细菌性食物中毒占首位。世界上最大的一起沙门氏菌食物中毒事件发生在1953年，瑞典人由于食用了被鼠伤寒杆菌污染的猪肉引起的中毒，中毒7717人，死亡90人。1972年青海市同仁县因圣保罗沙门氏菌污染牛肉引起的中毒事件，中毒1041人。沙门氏菌食物污染给国家造成巨大的经济损失，如1990年在向欧洲出口的生肉中检测到肠炎沙门氏菌，全部销毁的直接经济损失达3000万元。OIE法典2007年召开的陆生动物标准法典委员会会议上制定了《沙门氏菌的控制和预防指南》许多国家已经采取了沙门氏菌控制措施，并取得了良好的社会效益和经济效益。我国的沙门氏菌防控措施生鲜畜禽肉中的沙门氏菌污染状况养殖场中健康动物带菌情况养殖场环境中的沙门氏菌状况动物产品中沙门氏菌污染养殖场环境污染空气、水源、饲料、土壤金黄色葡萄球菌生物学特性---菌体形态及培养特征革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长分布在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。被污染的食物在室温20℃-22℃放置5小时以上时，病菌大量繁殖，并产生肠毒素。致病性葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。微生物学检验金黄色葡萄球菌菌检验中华人民共和国国家标准GB/T4789.4-200325g样品+225ml生理盐水5mL样品匀液（1:10）+50mL胰酪胨大豆肉汤血平板36±1℃24hr镜检血浆凝固酶实验报告结果36±1℃24hr36±1℃24hr36±1℃6hrBP平板定性检测微生物学检验金黄色葡萄球菌菌检验中华人民共和国国家标准GB/T4789.4-2003定量检测（平板法）25g样品+225ml生理盐水选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）平板计数（分别记录每种类型的菌落数）36±1℃48hr镜检营养肉汤血浆凝固酶实验报告结果金葡菌数/g(mL)每种类型至少选取一个菌落36±1℃24hr36±1℃6hr梯度稀释适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10/g（mL）的食品B-P平板控制措施防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。大肠杆菌O157︰H7EHECO157︰H7生物学特性EHECO157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性。其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性。。EHECO157:H7具有较强的耐酸性，pH2.5-3.