医学分子生物学技术

医学分子生物学技术刘湘帆结论：核酸是遗传物质（1944年）1953年第一讲基因总论第一节基因的概念第二节病毒基因组第三节细菌基因组第四节真核生物基因及其特点无论是病毒、原核生物或是真核生物，其RNA或蛋白质的结构信息都是以基因的形式贮存在核酸分子中。基因的概念遗传：生物性状相对稳定地从亲代传递至子代，使生物的物种得以保存。变异：生物在不断变化的环境中为适应生存而自身发生变化。变异是生物进化的源泉。基因的分子生物学定义位于染色体上呈直线排列的遗传单位。是编码有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列。基因的构成：--编码蛋白质或RNA的基因(结构基因，functionalgene)--具有调节功能的片段或序列，提供转录、复制、重组起始信号（调节基因,controlgene）一个基因应包括：--编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列--转录所必须的调控序列编码区上游5’端非编码序列内含子编码区下游3’端非编码序列基因组：一个细胞或生物体中一套完整的遗传物质的总和细胞基因组：一个细胞所有染色体上全部基因和基因间的DNA的总和人类基因组计划(HGP)：HumanGenomeProject美国科学家Dulbecoo于1986年率先提出，旨在阐明人类基因组DNA长达3×109对碱基的序列，发现所有人类基因并明确其在染色体上的位置，从而在整体上破译人类遗传信息。原核生物基因组生物包括：原核生物——原核细胞（细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体等）真核生物——真核细胞（多细胞动、植物及酵母等）非原核非真核生物——病毒、噬菌体原核细胞与真核细胞的特点原核细胞：无核膜、核仁，核物质分散，不形成明显的细胞核，遗传物质简单。无细胞器。真核细胞：有细胞核及核仁，遗传物质与蛋白质结合形成染色体集中于核中。有细胞器。原核细胞及真核细胞核酸的差异转录与翻译的方式不同DNA含量不同真核细胞有细胞器DNA（如线粒体DNA）转录翻译病毒及噬菌体：既非原核生物，又非真核生物。它们必须寄生于宿主细胞内进行繁殖，遗传机制随宿主不同而不同。噬菌体也是病毒，它是感染细菌和真菌的微生物病毒。细菌基因组的结构特点基因组多数由环状双链DNA分子组成具有类核结构操纵子结构类核（nucleoid）：染色体经高度折叠、盘绕聚集在一起，形成致密的类核。其中心为RNA和支架蛋白质组成，外周是双链闭合DNA结构。外层：环状双链DNA分子内层：RNA分子和蛋白质操纵子结构（operon）：功能上相关的几个结构基因往往串联排列在一起，受上游共同的调控区和下游转录终止信号所构成的基因表达单位。转录时，几个基因转录在一条mRNA链上，再分别翻译成各自不同的蛋白质。操纵子结构基因中无内含子，与真核细胞的主要区别。编码区基因占基因组比例约50%左右，存在间隔区。DNA绝大部分用于编码蛋白质，结构基因多为单拷贝，结构基因中无重叠现象（一段DNA序列编码几种蛋白质多肽链）基因组中存在重复序列基因组中存在可移动的DNA序列，如转座子和质粒等质粒独立于细菌细胞染色体以外，能自主复制的共价闭合环状DNA分子。作为一个完整的复制子，在转化细胞后能自主复制，并对细菌的一些代谢活动和抗药性表型产生重要作用，即给细菌带来特殊标志。质粒的生物学特点质粒中携带许多基因，影响生物学性状质粒可从一个细菌转移至另一个细菌，其携带的遗传性状也随之转移。质粒并非细菌生命活动所必需，其编码的性状对细菌有保护作用质粒的结构特点环状DNA分子含复制启动子，在其下游具复制起始点(ori)选择标记多克隆位点(polylinker)质粒特性1.质粒的主要成分为环状DNA分子，分子相对小。2.含有高效的自主复制成分3.选择的标记：如抗药性标记。4.限制性内切酶单一切口。5.质粒的复制依赖于宿主细胞。多克隆位点6.不相容性:携带相同复制子的质粒不能在同一细菌中共存。7.质粒转移性：可以在同种属或异种属之间转移。质粒的类型按复制机制：1.严紧型质粒：在“严紧”控制下复制的质粒。它的复制受到细胞蛋白的影响。一旦细胞复制停止，质粒拷贝数不能增加。低拷贝数质粒，每一个细胞只有一个或几个拷贝。2.松弛型质粒：高拷贝数质粒，每个细胞可含10-200个拷贝。细胞停止复制后质粒仍可继续复制。按质粒功能分型F质粒：决定细菌的性别，能将宿主染色体基因和它本身转移到另外一个宿主中。是一种游离的基因，可以整合到染色体基因组中。F`质粒ABCDF`质粒F`质粒FF`R质粒：抗药性基因包括临近的两个DNA分子片段，一个为抗性转移因子（转移基因、DNA复制基因等）和抗性决定因子（抗青霉素、抗氨苄青霉素等）单独的抗性决定因子只有在抗性转移因子作用下发生转移转位因子概念：转位因子（transposableelement）可移动的基因成分，即能在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段。转座子不依赖于供体和受体位点序列间的关系而定。转座子相对于那些可以从一个基因组转移到另外一个基因组的载体而言，如逆转录病毒或质粒等，转座子只是基因组内部的载体类似物，是基因内部突变的主要来源。转位因子的类型可分为插入序列、转座子、可转座的噬菌体ISaresmallDNAsegments(1-2Kbp)thatcanmovefromoneregionofDNAtoanother,typicallyinrandomfashion.Jumpinggenes.ISencodesanenzymeneededtoexciseDNAandintegrateitelsewhere.IStypicallyhavepromoterspointingtowardstheiredges.Thisallowsthemtoactivateneighboringgeneswheretheyareinserted.插入序列（insertsequence,IS）：插入序列是编码一种转座所需酶的一种转座子，它的两侧是短向重复序列。插入序列的靶序列在插入的过程中被复制，形成两个短的正向重复序列。IS：一个转座酶和两个反向重复序列转座子（transposon）也是一种转位因子，比IS大（约4500-20000bp）。转座子除了带有转座的必需的基因外，还可以有编码转座以外的其他基因。转座子中存在转位酶，可以介导转座子从一个位点转移到另一个位点。转座子具有一个中心区，其两侧各有一个IS元件。两者顺序可以相同也可以相反。转座子转座子意义：1基因重排2引入突变3产生新的基因二、大肠杆菌在基因工程中的应用：将目的片段重组于载体，并将此重组DNA转移到受体细胞内，后者便获得并表达重组DNA的遗传性状。大肠杆菌由于繁殖快，易培养，故常将其作为受体细胞。大肠杆菌的遗传物质：染色体DNA相对集中形成类核，全长1100~1400m，含4288个开放读码框架。质粒DNA：存在于细胞质中的小的环状DNA分子，能自主复制。大肠杆菌基因组的特点：基因组：4639221个碱基对，约3500个基因。已经鉴定的基因有1500多种，主要是与酶类有关的基因。大多数基因分散排列在整个染色体的不同区域，即使相关的基因也可能分布在不同的部位操纵子结构：功能上相关的结构基因常串联在一起组成操纵子结构大肠杆菌基因图谱划分成100等份。细菌基因组研究的意义：1深入研究发病机制2开发有效治疗药物3提高临床诊断率4制备疫苗提供参考病毒基因组特点病毒基因组核酸-核心蛋白质-外壳病毒颗粒病毒基因组特点：基因组可由DNA组成，也可由RNA组成；但只可以由其中的一种组成。基因组小，基因数目少，重复序列少。存在重叠基因(一个基因编码几种蛋白质)。噬菌体基因无内含子，结构连续；病毒中含有内含子，结构间断。基因组内存在操纵子结构。如噬菌体ǾX174基因组的大部分用来编码蛋白质。大多数为单倍体。DNA病毒的特点DNA病毒基因组以双链DNA为多数，可以是环状也可是线状。线形DNA分子末端多含有反向重复序列。真核DNA病毒在宿主细胞核内复制。DNA病毒一般较RNA病毒大，生活周期复杂。举例（—）SV40猴肾细胞中分离。双链环状DNA，5243bp。基因组复制依赖于宿主，可分为早期复制和晚期复制。早期复制，逆时针方向，生成T，t抗原；晚期复制，顺时针方向，生成VP1、VP2、VP3举例（二）乙型肝炎病毒（HBV）双链为环状双链，长链为（L（-））；长度固定携带全部的编码信息。短链（S（+）），长短不一，5`端固定，两条链的5`端序列互补，保持环状结构，同时也是最常整合肝细胞染色体的DNA序列。HBV基因有4个ORF，分别为S、C、P、X区；S区分为S基因、前S1基因和前S2基因；编码外膜蛋白；前S区与病毒的嗜肝性有关。C区编码HBcAg；前C和C区编码HBeAg；变异率较大区域P区：是最长的一段，与其他部位有重叠，编码产物是依赖于RNA的DNA聚合酶；X区：编码蛋白为HSxAg，是一种反式作用因子，与病毒基因表达有关。内衣壳蛋白外衣壳蛋白RNA病毒的特点：RNA病毒多数为单链，少数也可以呈双链；RNA基因组的遗传信息一般在一条链上；RNA病毒的变异率很高RNA病毒的复制和转录常独立于宿主细胞核丙型肝炎病毒具有1个ORF，5`和3`端为非编码区；5`UTR具有蛋白结合部位，序列非常保守；HCV翻译的蛋白质主要有结构蛋白和非结构蛋白两种。结构蛋白为核心蛋白和包膜糖蛋白。它们分别是由C区、E1和E2/NS1区。其他为非结构蛋白。HIV病毒HIV病毒属于逆转录病毒，有HIV-1和HIV-2两型。大部分是HIV-1。HIV基因组由2条正链RNA在5`端连接形成二聚体。单链RNA有9个基因，其中3个结构基因（gag、pol、env）病毒基因组5`端和3`端各有一个长末端重复顺序（LTR）结构基因为gag、pol、env；非结构基因tat、rev、nef、vif、vpr、vpuGagp55前蛋白p24(衣壳蛋白)p17（内膜蛋白）p7（核衣壳蛋白）Pol编码逆转录酶、蛋白水解酶和整合酶，与病毒复制密切相关Env编码包膜前体蛋白，产生gp120(外膜蛋白)和gp41(穿膜蛋白)介导病毒包膜和宿主包膜融合有宿主细胞表面CD4分子结合位点envgagpol病毒复制RNA酶HHIV病毒复制第五节真核生物基因及其特点真核生物基因组包括核内染色体DNA和核外细胞器DNA两部分。一、真核生物基因组的一般特点（核染色体）基因组庞大双倍体单顺反子结构重复序列结构基因不连续排列(外显子、内含子)即断裂基因非编码区域多于编码区域(与蛋白质合成有关的基因只占整个基因组的2%)真核生物基因组的C值矛盾C值：一个单倍体基因组中的全部DNA量。生物体的结构与功能越复杂，基因组DNA应越多，C值越大。C值矛盾：形态学复杂程度与C值大小不一致。难以解释的现象：人类基因组3.1×109硷基对基因数仅3~3.5万个仅2%~3%的DNA序列用于编码蛋白质剩余DNA具何功能？？单顺反子结构单顺反子：一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。断裂基因（splitgene）真核细胞的基因大多由不连续的几个编码序列所组成，即断裂基因。一个完整的转录单位包括外显子、内含子和5`和3`的非编码区序列。间隔区DNA：存在于编码空白区或转录空白区的序列。往往在单拷贝的结构基因侧翼，使结构基因彼此分开。间隔区随基因组增大而比例升高真核生物染色体DNA中存在许多不同程度的重复序列，根据DNA序列出现频率的不同而分为不同类型。1在基因组中仅出现一次或少数几次，大多数基因(50%~80%)在单倍体中都为单拷贝。2.中度重复序列重复次数为数十至数万(105)次，长度多在300~7000bp，多为不编码序列，与单拷贝基因间隔排列。如Alu家族、KpnI家族、rRNA等。(1)Alu家族哺乳动物及人类基因组中最广泛的一种中度重复序列，占基因组DNA总量3%~6%。长度为300bp，在170bp处有AluⅠ的酶切位点。分布在基因组间隔序列及内含子中，平均每5kb即有一个参与附近基因的活化，DNA复制的起始及前mRNA的加工等。(2)KpnⅠ家族