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第九章蛋白质分析与蛋白质组学中山大学中山医学院吴忠道ProteinAnalysisAndProteomics主要内容第一节引言第二节蛋白质分析方法第三节蛋白质组学数据的获取与分析蛋白质组(proteome)源于蛋白质(protein)与基因组(genome)两个字的结合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学(proteomics)，是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式作为研究对象，注重研究参与特定生理或病理状态的所有蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。第一节引言蛋白质组学研究的策略：蛋白质组学研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定，并分析蛋白质间的相互作用和功能。1.一种称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质。2.另一种策略称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。蛋白质组学的研究范围：一种是“完全”蛋白质组学或表达蛋白质组学(expressionproteomics)，主要分析构成蛋白质组蛋白质的种类和数量，并以此来探讨细胞、组织、个体或特定状态的特征。另一种是“差异”蛋白质组学或功能蛋白质组学，主要筛选和鉴定不同种类或状态下各样品间蛋白质组的区别与变化，通过分析蛋白质组中构成蛋白质间相互作用及细胞内功能单位，解析蛋白质组与细胞功能之间的相关性。功能蛋白质组学（functionalproteomics）”研究细胞或个体在某一特定时间所表达或与某个功能相关的蛋白质集合体。功能蛋白质组学能够在细胞和生命有机体的整体水平上阐明生命现象的本质和活动规律。功能蛋白质组学的研究可为食品改造、疫苗开发和生物制药等提供重要依据。功能蛋白质组学已成为后基因组的重要组成部分。主要研究内容：1.蛋白质组的组成成分，即蛋白质组的表达模式(expressionprofile)2.蛋白质翻译后修饰3.蛋白质-蛋白质相互作用一、蛋白质的指纹特征二、蛋白质的定位、修饰三、蛋白质分析软件与数据库第二节蛋白质分析方法一、蛋白质的指纹特征1.蛋白质的指纹即肽质量指纹谱具有特征性由于每种蛋白质的氨基酸序列（一级结构）都不同，蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具有特征性，称为肽质量指纹谱（peptidemassfingerprinting，PMF），即蛋白质的指纹特征。一、蛋白质的指纹特征2.肽质量指纹谱是鉴定蛋白质的常用参数质谱指纹分析需要经过蛋白质原位酶解（包括蛋白质凝胶的脱色、还原和烷基化、酶解、萃取及合并萃取液冻干后进行质谱分析）、MALDI-TOF肽质量指纹图测定（包括蛋白样品脱盐及制备、质谱仪进行肽质量指纹图测定）及蛋白质鉴定数据库搜寻等三个步骤。一、蛋白质的指纹特征3.肽质量指纹谱可用作其他测定参数•测定不同物种间的保留特性，从而推断分子的功能。由生物多样性和进化上远离引起的氨基酸残基取代，显示了蛋白中的特征功能区。•在一个蛋白消解物中，用来检测在化学或酶处理前后的“非匹配”（即和预测片段不符）的肽，从而表征蛋白的修饰。二、蛋白质的定位、修饰蛋白质功能模式的研究是蛋白质组研究的最终目标，其主要研究目标是要揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。蛋白质定位、蛋白质翻译后修饰及蛋白质-蛋白质相互作用都是目前其研究的重要内容。蛋白质的定位1.蛋白质的定位基于十二类亚细胞结构蛋白质在细胞内的定位主要基于12类亚细胞的分类数据库（来自SwissProt）：细胞膜、细胞质基质、内质网、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、细胞骨架、液泡、细胞核、细胞外基质。二、蛋白质的定位、修饰2.蛋白质在细胞内合成后的转运与定位有两种机制翻译后转运（post-translationaltranslocation）共翻译转运（co-translationaltranslocation）二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的定位3.生物信息学预测亚细胞定位构建可靠的数据库，对蛋白质的亚细胞定位进行分析与预测，能加速蛋白质亚细胞定位的研究。综合数据库（SwissProt、MIPS等）模式生物数据库专门的亚细胞定位数据库二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的定位4.蛋白质信息的提取是亚细胞定位预测的基本步骤二、蛋白质的定位、修饰蛋白质分选信号蛋白质序列的氨基酸组分蛋白质的功能域信息序列比对信息GO注释信息氨基酸物理化学性质混合性特征参数蛋白质的定位蛋白质翻译后修饰（post-translationalmodification，PTM），即是指蛋白质在翻译中或翻译后会在个别氨基酸链上共价结合各种非肽类基团，形成翻译后修饰。蛋白质翻译后修饰在体内是一个动态的变化过程，有效探明细胞和组织内蛋白质修饰谱的“翻译后修饰蛋白质组学”成为当今功能蛋白质组学研究的重要内容。二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的修饰1.蛋白质的翻译后修饰是蛋白质行使正常生理功能所必需的蛋白质翻译后修饰过程使蛋白质结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。常见的蛋白质翻译后修饰类型：磷酸化、糖基化、甲基化、泛素化、脂基化等。二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的修饰二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的修饰2.质谱是鉴定蛋白质翻译后修饰的重要方法•蛋白质翻译后的修饰的解析主要采用电喷雾（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）两种质谱技术。•质谱主要通过质量偏移（massshift）来识别翻译后修饰蛋白。3.基于质谱数据鉴定翻译后修饰的结果分析采用数据库搜索法由质谱数据鉴定翻译后修饰肽段的主要方法分为两大类：数据库搜索法（databasesearching）和从头测序法（DeNovosequencing）。常用的数据库搜索法有SEQUEST、Mascot、X!Tandem、MS-Align等。二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的修饰4.生物信息学预测和鉴定方法有助于蛋白质翻译后修饰的研究生物信息方法的介入，能够从序列和质谱两个角度帮助大规模鉴定翻译后修饰，有助于翻译后修饰蛋白质组学研究的迅速发展。二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的修饰5.基于序列法是预测蛋白质翻译后修饰的重要生物信息学方法同类翻译后修饰位点周围的片段往往都具有很强的序列保守性，通过对常见翻译后修饰的数据的收集，及对发生同类修饰的蛋白序列特征的研究如保守motif，从而能够基于序列预测翻译后修饰。二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的修饰1.蛋白质相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础生命的基本过程就是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用的结果。细胞各种重要的生理过程，包括信号转导、细胞对外界环境及内环境变化的反应等，都是以蛋白之间相互作用为纽带，并形成网络。二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的相互作用2.蛋白质的特定结构域是介导蛋白质-蛋白质间相互作用的基础典型蛋白质相互作用的结构域是一个具有结合专一性的独立折叠元件，可以插入新的蛋白质中并保留结合靶部位的能力。它们的相互作用多是通过2个多肽表面几何构型和静电力而相互连接。二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的相互作用3.实验方法是鉴定蛋白质-蛋白质间的相互作用的主要方法酵母双杂交系统噬菌体表面展示技术蛋白质亲和色谱表面等离子共振技术荧光共振能量转移技术二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的相互作用抗体与蛋白质阵列技术免疫共沉淀技术Pull-down技术亲和印迹化学交联技术蛋白质探针技术基于质谱的蛋白质相互作用研究方法二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的相互作用4.生物信息学是蛋白质相互作用研究的有力工具，蛋白质相互作用数据库是预测蛋白质间相互作用的基础使用最广泛、数据信息最完善的人类相关的蛋白质相互作用公共数据库有：BIND,DIP,IntAct,HPRD,MINT,MIPS二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的相互作用5.预测蛋白质相互作用的生物信息学算法基于基因组信息的预测方法基于进化信息的方法基于蛋白质一级结构的从头预测方法需要三维结构信息的方法二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的相互作用6.蛋白质相互作用网络的构建是研究蛋白质相互作用的最终目标蛋白质网络可以显示蛋白质从细胞表面到细胞核的一系列变化过程，揭示参与该过程的一系列生物学事件和作用因子，提示某一过程的中断或变化可能导致的生物学后果等。二、蛋白质的定位、修饰蛋白质的相互作用蛋白质的分析通常是指对未知或已知蛋白质结构及功能的预测与解析。对蛋白质的分析基于蛋白质数据库的信息。与蛋白质分析有关的主要有蛋白质一级结构序列数据库、蛋白质三维空间结构数据库等一次（级）数据库，及构建而成的具有特殊生物学意义和专门用途的蛋白质二次（级）数据库。三、蛋白质分析软件与数据库（一）蛋白质物理特性的预测基于蛋白质的一级氨基酸序列从蛋白质序列出发，可以预测出蛋白质的许多物理性质，包括等电点、分子量、酶切特性、疏水性、电荷分布等。相关工具有：ComputepI/Mw，PeptideMass，TGREASE，SAPS等。三、蛋白质分析软件与数据库（二）蛋白质二级结构预测以已知三维结构和二级结构的蛋白质为依据二级结构是指α螺旋和β折叠等规则的蛋白质局部结构元件。不同的氨基酸残基对于形成不同的二级结构元件具有不同的倾向性，这构成了进行二级结构预测的基础。二级结构预测常用方法有：nnPredict，PredictProtein，SOPMA，COILS，TMpred，SignalP等。三、蛋白质分析软件与数据库（三）蛋白质三级结构预测是最复杂和最困难的预测技术蛋白质结构预测最终是要从蛋白质的氨基酸序列预测出其三维空间结构。由于蛋白质的折叠过程仍然不十分明了，从理论上解决蛋白质折叠的问题仍较困难。有一定作用的三维结构预测方法最常见的是“同源模建”和“Threading”方法。三、蛋白质分析软件与数据库（四）蛋白质功能预测主要根据序列预测功能思路及一般流程为：通过相似序列的数据库比对确定功能。确定序列特性，如疏水性、跨膜螺旋和前导序列等。通过序列模体数据库等的比对确定功能，查未知序列是否包含保守序列模体。查对搜索Prosite等数据库最终预测蛋白质功能。三、蛋白质分析软件与数据库（五）蛋白质分析有很多其他非在线软件包工具除了在线分析工具之外，尚有很多非在线的蛋白质分析软件包工具得以开发如：AnthePro，PSAAM，VHMPT，MPEx等。三、蛋白质分析软件与数据库（六）常用蛋白质一次序列数据库有PIR、SwissProt、NRL-3D、TrEMBL、GenPept等（七）蛋白质二次序列数据库是由一级序列数据库整合而来的复合数据库将一次数据库整合起来构建成复合数据库或二次数据库，更有利于生物学家的使用。蛋白质序列二次数据库主要有：Prosite，OWL，NRDB等。三、蛋白质分析软件与数据库（八）蛋白质一次结构数据库有PDB、SCOP、CATH等蛋白质空间结构数据库是生物大分子结构数据库的主要组成部分，是随X射线晶体衍射分子结构测定技术的出现而出现的数据库，其基本内容为实验测定的蛋白质分子空间结构原子坐标。三、蛋白质分析软件与数据库（九）蛋白质二次结构数据库如：蛋白质二级结构构象参数数据库（DSSP）、蛋白质家族数据库（FSSP）、同源蛋白质数据库（HSSP）等。三、蛋白质分析软件与数据库第三节蛋白质组学数据的获取与分析一、二维凝胶电泳分析技术二、蛋白质组质谱分析技术三、蛋白质芯片分析技术四、酵母双杂交系统五、RosenttaStone方法六、蛋白质组学分析软件与数据库一、二维凝胶电泳分析技术二维凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)是目前所有电泳技术中分辨率最高、信息最多的技术（一）二维凝胶电泳技术的定义及特点第一向是等电