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第一章RNA的提取和cDNA的合成RT-PCR原理提取总RNA以其中的mRNA作为模板反转录cDNAPCR作模板获得目的基因一、RNA的提取RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮肤、手指、试剂、容器等。采取的措施：1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。2、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘烤2h以上。3、不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、试剂等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，然后高压灭菌以消除残存的DEPC。注意事项：1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。2、DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和DTT（二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。总RNA提取方法（试剂盒）：异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol法）原理：（1）Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。酚是有效的蛋白变性剂，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。（2）氯仿可使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。其主要作用是分相，实际上是加速有机相和水相的分层。上层水相，pH5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA就会溶解在水相，（导致pH中性的原因可能是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量）。同时，氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。（3）异丙醇作用是沉淀RNA。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必是你的RNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。（4）因为上述试剂会影响后续实验，所以用75%乙醇洗1-2次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿，乙醇易挥发，痕量的乙醇很容易挥发掉。YeastTotalRNA二、cDNA的合成反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶种类：两种1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶包括两个多肽亚基（最适温度42℃）活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。2、鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶只有单个多肽亚基（最适温度37℃）活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV反转录酶差。M-MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。cDNA引物种类：1、随机引物：不特异的引物体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物绝大多数真核细胞mRNA具有3’-端Poly(A)尾，此引物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3、特异性引物用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。第二章聚合酶链式反应（PCR）*PCR，即聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）,是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。*由1985年穆里斯（K.Mullis）发明，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR的原理：体外DNA复制包括高温变性、低温退火和中温延伸过程。一、PCR基本步骤三个步骤：1、变性(Denature)：双链DNA目的片段在94℃下解链。2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。3、延伸(Extension)：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度(72℃左右)下，以目的DNA为模板进行合成。二、PCR反应中的主要成分引物：好坏是PCR成败的关键。设计原则：1、引物长度约为16-30bp。2、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。3、四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。4、引物3'-端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。5、在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构，且3’-端尽量不用A，尤应避免连续2个或2个以上A，因为A引发错配的几率高；最好选择T。6、两引物之间尤其在3'-端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。7、引物5'-端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在5'-端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。引物浓度：一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。Mg2+：Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。模板：PCR中模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中模板量为102-105个拷贝。扩增单拷贝基因，需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。多拷贝基因扩增用量更少。模板过多可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。反应结束后，需要灭活TaqDNA聚合酶。灭活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR产物经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(3)99-100℃加热10min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，可稳定酶活性；加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长DNA片段有利。各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的缓冲液。