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一、总的RNA的提取基础知识：(1)DEPC：中文名为焦碳酸二乙酯。分子式为C6H10O5，分子量为162.14。是一种强烈的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。DEPC水一般是指千分之一浓度的DEPC,在搅拌器上搅拌至完全溶解，即看不到“油珠”为止，DEPC气味芳香浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作。(2)RNA分子：哺乳动物细胞有3种rRNA：28S、18S和5S。一个典型的哺乳动物细胞含有10-5μgRNA，其中80～85％为rRNA，其余15～20％主要由各种类型的低分子量RNA组成(tRNA、核内小分子RNA等)，这些高丰度的RNA分子具有确定的大小和核苷酸序列、并能用电泳、密度梯度离心、阴离子交换或高效液相层析等技术分离纯化。mRNA与上述RNA不同，其含量为细胞总RNA的1～5％，大小和核苷酸序列各不相同，从数百至数千碱基不等。..多数真核细胞mRNA在其3端均有一poly(A）尾，使得mRNA可以通过挂有oligo(dT)-纤维素的亲和层析柱分离纯化，获得的异源性分子集群的总体，可编码细胞内所有的多肽。RNA酶变性剂RNA酶：水解RNA。•含有链内二硫键，使其能抵抗长时间的煮沸和温和变性剂。另外，变性后可迅速折叠，目前，尚无RNA酶失活的简易办法。•该酶不需要二价阳离子激活，难以被金属离子鳌和剂（EDTA）失活。——只好避免污染！用强烈变性剂，如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。..RNA酶可耐受多种处理(例如煮沸)而不失活，但却会被4mo1/L硫氰酸胍和β-疏基乙醇等还原剂所灭活。因此可联用上述试剂，从组织中提取完整无损的RNA实验准备工作：器具和试剂的消毒..（1）尽可能使用无菌、一次性塑料制品，已标明RNase-Free且未开封过的塑料制品，不必再进行其他处理，对于国产塑料制品，应按下列方法进行处理：在一玻璃烧杯中注入含终浓度为0.1%DEPC的去离子水，将要处理的塑料制品浸泡其中12小时以上，弃DEPC水溶液，适温烘烤干燥已处理过的塑料制品，再经103.4kPa，121℃高压灭菌15分钟，70-80℃烘烤干燥即可使用..（2）所用的玻璃器皿，置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。..凡是不能用高温烘烤的材料，如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再用蒸馏水冲净。（3）DEPC：..DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。..DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。（4）试剂也可用DEPC处理：加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。（5）Tris溶液：用DEPC处理的水配制，然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。.（6）除DEPC外，也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。（7）此外，为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。实验原理：Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍和酚等物质，能迅速破碎细胞和溶解细胞中的其它成分，抑制细胞释放出核酸酶，维持细胞中RNA的稳定，加入氯仿离心后，RNA进入水相，再用异丙醇沉淀水相中的RNA，即可达到提取总RNA的目的。实验步骤（Trizol法提取总RNA）：1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液（观察：液体变粘稠，细胞脱壁），注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%，否则会出现DNA的污染。2、研磨液室温放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。3、室温静置2-3分钟后,12000g离心10分钟4℃，离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总TRIZOL的60%。取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟4℃，观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀）。4、按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇（用DEPC水新配制），涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。..5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。部份溶解的RNA样品其A260/280ratio1.6然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟，测定OD值（OD260/280值在1.8-2.0视为纯度很高）。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。6、电泳影响RNA提取的因素：（1）样品破碎及裂解动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻。样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量（2）纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；RNA提取常见的问题：（1）RNA降解新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。（2）OD260/OD280比值偏低蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。（3）电泳带型异常非变性电泳：上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。变性电泳条带变淡：EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。（4）下游实验效果不佳RNA降解抽提试剂的残留75%乙醇洗涤样品中杂质的残留多糖等杂质，再次沉淀DNA污染使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNA实验中常见问题及原因分析：1.RNA的产量低可能的原因：1）RNA溶解不完全；2）离心速度过大（大于12000g）;3）加入Trizolreagent后，匀质化不完全，应在室温下放置一段时间后，再加入氯仿。2.RNA降解可能的原因：1）加入Trizolreagent以前，细胞处理步骤过多，改正：弃尽上清，直接加入Trizolreagent，室温放置即可；2）不正确的储存方法：应存于-70°C，而不是-20°C。3.A260/280少于1.65可能的原因：1）加入Trizolreagent量不够，而使细胞匀质化不完全；2）溶解RNA的溶液偏酸。注意事项：（1）由于mRNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。（2）.所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。（3）.整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。（4）.加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。（5）.RNase酶是导致RNA降解的最主要的原因，它广泛存在于人的皮肤上，而RNase酶非常稳定，用常规的高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase酶完全失活，因此，实验时一定注意戴手套，同时所有的实验用具需经0.1%的DEPC水处理12小时以上，以去除RNase酶。（6）.Trizolreagent、氯仿、DEPC水是剧毒物质，要注意防护。在吸取浓DEPC水，或用DEPC水处理塑料制品时，要注意在通风柜中进行。（7）操作时不要讲话。二、从总的RNA中提取mRNA基础知识：mRNA纯化缓冲液：1×层析柱加样缓冲液；20mmol/LTris·Cl(pH7.6)，0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.1%SDS。灭菌洗脱缓冲液：10mmol/LTris·Cl(pH7.6)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.05%SDS。mRNA分离纯化原理：利用mRNA3‘末端含有多聚(A)+的特点，当分离的总RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA。（利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点，合成一段Oligo（dT）引物，根据碱基互补配对的原则，可将mRNA从总RNA中分离出来。）(分离的总RNA可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。)纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。方法一oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA的步骤：1、用0.1mol/LNaOH悬浮0.5-1.0goligo(dT)纤维素。2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。4、将提取的总RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析加样缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD260为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。7、加入1/10体积的3MNaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。RapidmRNAPurificationKit(AmrescoInc.)A.用rapidmRNAbindingbuffer悬浮活化的oligo(dT)celluloseB.取100ul(最多25ug,1/5样品),