RNA相关技术在生命科学研究中的应用

[e-mail]相关技术在生命科学研究中的应用摘要自DNA双螺旋模型发现以来，生命科学的研究的重点就集中在了DNA，我们从基本的组成、结构知道所包含的遗传信息和功能方面进行了详细的研究。而RNA作为一个新兴的研究热点，展现了其在生命中发挥着重要的作用，并且有很多新的机制是不为我们所知的。其中，RNA干扰的发现，更是为使理论生物学的研究插上了一双“翅膀”，我们可以站在更高的层次去了解生命。RNA干扰是由双链RNA引起的序列特异的基因沉默现象。由于RNA干扰能在细胞组织及动物模型中沉默疾病相关基因，因此，RNA干扰也是各种疾病治疗的有效手段。在哺乳动物细胞内诱导RNA干扰可以通过导入小干扰RNA(siRNA)，或是以质粒、病毒为载体表达短的发夹RNA(shRNA)而实现。ProgressinRNAinterferencetherapeuticsAbstractRNAinterference(RNAi)isaconservedbiologicresponsetodouble-strandedRNAthatresultedinthesequence-specificsilencingoftargetgeneexpression.RNAiisavaluabletoolinthetreatmentofdiseasesforitspotencytosilencedisease-associatedgenesintissuecultureandanimalmodels.RNAicanbeinducedinmammaliancellsbytheintroductionofchemicallysynthesizedsmallinterferingRNAs(siRNAs)orbyplasmidandviralvectorsthatexpressshort-hairpinRNAs(shRNAs)thatcanbeprocessedtosiRNAsbythecellularmachinery.Inthisreview,wefocusonthepotentialtherapeuticuseofRNAi.Alsoreviewed,arethechallengesinvolvedindevelopingRNAiforclinicaluse.1995年，康乃尔大学的SuGuo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现SuGuo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级。该小组将这一现象称为RNA干扰。在1999年短短的一年间,发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞。2000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在ＲＮＡ干扰现象。[e-mail]干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA引起的序列特异的基因沉默现象。人们通常采用两种方式实现RNA干扰：一种是向细胞直接转染人工合成的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA);另一种则是以质粒或病毒为载体表达短的发夹RNA(short-hairpinRNA,shRNA)。由于RNA干扰具有特异性、高效性及多能性的优点，近年来已被广泛用于各种疾病的治疗。第一章RNA干扰的机制1.1siRNA参与的RNA干扰RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片断，即siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应[11]。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导（guidestrand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇（Drosophilamelanogaster）RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AGO2)的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（sliceractivity），RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶(RNAhelicase)也被鉴定为参与RNAi机制的因子。在秀丽隐杆线虫（C.elegans）的RNAi中必须的因子有EGO1。这是一种RdRP(RNA-dependentRNAPolymerase)，植物中也存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA(或siRNA)作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。1.2microRNA参与的RNA干扰已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构，约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21—25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。最近3个研究小组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNAs中，有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性（只有有1—2个碱基的区别），Lau和Bartel实验室的同事更加认为：所有的miRNAs可能在其他物种中具有直向同源物[e-mail]（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类，这些类似的基因被称为“直向同源物”）。Bantam最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的一个基因位点。已知几个包含增强子的转座子插入跨越这个位点的一段12.3kb区域会导致果蝇的眼和翅重复生长，而由转座子介导的一段跨越该位点的23kb片断缺失则导致突变果蝇个体小于野生型果蝇。Cohen和同事用一段3.85kb的片断导入21kb片断缺失的果蝇中使其恢复原来的大小。但是奇怪的是表达这个3.85kb片断中的EST却没有同样的效果。Cohen将这个片断和疟蚊Anophelesgambiae的同源序列进行比较，发现一段90bp的高度保守区，经过RNAfoldingprogram(mfold)发现这个保守序列可以形成发夹结构，使得这个区段很象是一个miRNA的前体。这个结果经过Northernblot证实突变果蝇的幼体缺少一个21bp的bantammiRNA，用这个90bp的mRNA前体经过一系列的“功能缺失”—“功能恢复”实验，证实bantammiRNA在细胞增殖中的作用。研究人员用计算机程序检索在hidmRNA的3’非编码区找到了bantam的3个潜在的结合位点（hid是果蝇中一个诱导凋亡的基因），并证实bantammiRNA抑制hid的翻译而非转录。miRNAs的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式（amorerestrictedspatialandtemporalexpressionpattern）——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。在真核生物当中，还存在另外一种小分子RNA（microRNA）也能引起RNA干扰现象。microRNA大多20-22nt长，前体具有类似发夹性的茎环结构。microRNA产生于该茎环结构的双链区。其特点与siRNA基本上相同。科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNAs中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性（differentialspatialandtemporalexpressionpatterns），提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，因而具有重要意义。第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译从而调控线虫发育进程(reviewedinPasquinelli2002)。bantammiRNA是第一个被发现有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知还有一些miRNAs可能参与在细胞分化和组织发育过程中起重要作用的基因的转录后调控，例如mir-14、mir-23等。在植物miRNAs的研究中有两条线索提示miRNAs可能参与植物的发育过程。一是在carpelfactory(car)突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。CARPELFACTORY是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育。对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育(Reinhart2000)，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡(Brennecke2003），脂肪代谢（Xu2003)和细胞分化(Kawasaki2003)。此外，一个研究表明，2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关，提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin2002)。由于miRNAs存在的广泛性和多样性，提示miRNAs可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段，据推测miRNAs在高级真核生物体内对基因[e-mail]表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是：miRNAs可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。然而，大多数miRNAs的功能仍然是个谜。第二章RNA干扰在疾病治疗方面的应用2.1病毒感染RNA干扰是宿主抵御病毒入侵的手段，这一技术最早被用于防止病毒感染。近些年，一系列病毒基因组的破译为RNA干扰抗病毒治