RT-PCR法探讨茉莉酸甲酯对Taxol生物合成的影响

RT-PCR法探讨茉莉酸甲酯对Taxol生物合成的影响陈小文段留生董学会*中国农业大学农学与生物技术学院北京100094摘要：本试验应用HPLC法测定了茉莉酸甲酯（MJ）处理后，东北红豆杉叶片中紫杉醇含量的变化，并运用RT-PCR技术检测了紫杉醇生物合成7个相关基因的表达差异，结果表明MJ在处理后第20天，紫杉醇含量明显高于对照；7种关键酶基因的表达活性在处理后第4天明显提高，其中GGPPS活性为对照的6.65倍，TBT活性为对照活性的941%。关键词：紫杉醇GGPPS紫杉烯合酶生物合成ExplorationoftheChangesinKeyTaxolBiosysthesisProcesseswhenTreatedbyMethylJasmonate(MJ)ResortingtoRT-PCRChenXiao-wen,DongXue-hui*,DuanLiu-shengCollegeofAgriculturalandBiotechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,ChinaAbstract:HPLCwasusedforcontentdetectiontaxolinleavesofTaxuscuspidata,andthemethodofRT-PCRwasappliedforcheckofexpressionactivitiesofthesevenkeygenesintaxolbiosysthesis.Theresultsshowedthattheaccumulationoftaxolintreatmentwasnotablyhigherthanthatincontrol,andtheexpressionofthesevengenesweremoreactiveonthefourthdayaftertreatment,forexample,theGGPPSactivitywas6.65timesthatincontrolandTBTactivitywas941%ofthatincontrol.Keywords:TaxolGGPPStaxadienesynthaseMethylJasmonate前言紫杉醇（taxol），从红豆杉属植物中提取的二萜类次生代谢物，是一种广普的抗癌药物，可应用于治疗乳腺癌、子宫癌和肺癌以及与爱滋病相关的Kaposi肉瘤等，但该成分在红豆杉中的含量很低，而且野生的红豆杉资源有限，目前人工栽培红豆杉植物是紫杉醇最主要的来源[1，2]。茉茉莉酸或茉莉酸甲酯是已经确定的植物防御反应中基因信号转导系统中的主要信号转导分子[3,4]，已有文献报道茉莉酸甲酯能提高taxol、BaccatinⅢ和BaccatinⅥ等紫杉烷类化合物的产量[5]，是紫杉醇生物合成的诱导剂[6]。虽然目前对紫杉醇生物合成研究逐步深入，其合成途径的也逐渐阐明[7-9],B.H.Guo[10]等还对此作了详细的描述（见图1），但一些外源物质对紫杉醇合成的作用机理还没有无明确报道。目前用于临床的紫杉醇主要是从红豆杉的树皮和针叶中提取的，如何提高植株中利用人工繁殖栽培扩大红豆杉资源是目前的紫杉醇资源的可靠途径，而针叶是红豆杉植株中可再生的部位，因此如何适时采收以保证紫杉醇的含量较高是目前比较需要探讨的问题。本试验运用RT-PCR技术检测了茉莉酸甲酯处理后紫杉醇生物合成中GGPPS、10-deacetylbaccatinIII-10-O-acetyltransferase(DBAT)、taxoid10-betahydroxylase、taxadienesynthase(tasy)、taxadiene5-alphahydroxylase、taxadien-5-alpha-ol-O-acetyltransferase、2-alpha-hydroxytaxane2-O-benzoyltransferase(TBT)7个相关基因的表达差异，希望能进一步了解紫杉醇生物合成的代谢途径，为生产中红豆杉的合理采收提供理论依据。Taxolbiosyntheticpathway.ggpps:geranylgeranyldiphosphatesynthase;ts:taxadienesynthase;h-5_:cytochromeP450taxadiene5_-hydroxylase;tat:taxa-4(20),11(12)-dien-5a-ol-O-acetyltransferase;h-10_:cytochromeP450taxane10_-hydroxylase;tbt:taxane2a-O-benzoyltransferase;dbat:10-deacetylbaccatinIII-10-O-acetyltransferase.Multiplearrowsindicateseveralasyetundefinedsteps.图1紫杉醇生物合成图（B.H.Guoetal,2006）1材料和方法1.1试验材料东北红豆杉扦插两年苗购于黑龙江省苇河林业局。选取生长健壮较一致的扦插苗于温室（白天20℃，晚上4℃）中缓苗18天后，结合试验三的结果，选取100µM.L-1茉莉酸甲酯进行喷施处理，对照喷施蒸馏水，平均每株4ml处理液。分别于第4、8、12、16、20天取当年生新叶，用纱布包好部分样品放到液氮中30min后置于-80℃低温冰箱中保存用于荧光定量PCR测定taxol合成中相关基因的活性表达，余下样品于65℃烘箱中烘干至恒重用于紫杉烷类物质检测，每个样品3次重复。1.2测定方法1.2.1紫杉醇及其前体含量的测定紫杉醇及其前体的提取：称取烘干样品0.2g放到10mL试管中，加入4mL甲醇于超声波清洗器中超声处理0.5h，取出浸泡液10000r/min下离心5min，取上清于通风厨中吹干后用1mL甲醇溶解，经0．22μm微孔滤膜过滤，供HPLC分析紫杉醇（Taxol）、巴卡亭III（BaccatinIII）与10-去乙酰基巴卡亭III（10-DAB）。HPLC分析参考JianwenWang[11]等方法。1.2.2．总RNA提取：⑴用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品，每500mg样品，加入0.05g石英砂及0.05gPVP，液氮内用研钵磨碎，转入预冷的1.5ml离心管中。⑵在离心管中加入1.5ml变性液，-70°C冻融两次，56°C温育1-3min。将离心管放于冰上，分为两管，每管加入750ul2mol/l的NaAc-Hac（pH4.0），冰浴10min，4°C12000rpm离心10min，转移上清至一干净的管中。加入500ul5mol/l的Kac，冰浴20min，4°C12000rpm离心10min，转移上清至一干净的管中，加入750ul水饱和酚，150ul氯仿/异戊醇，震荡混合均匀，冰浴10min，4°C15000rpm离心30min，转移上清至一干净的管中，加入等体积异丙醇，-20°C1小时，4°C13000rpm离心25min。⑶去上清，100ulDEPC水溶解，加入1ml的裂解液RL裂解。⑷在15-30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。⑸每1mlRL加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。⑹于4℃12，000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。⑺加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）。⑻10，000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。⑼加500μl去蛋白液RE，12，000rpm离心45秒，弃掉废液；加500μl去蛋白液RD，12，000rpm离心45秒，弃掉废液；加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。⑽取出吸附柱RA，放入一个RNasefree离心管中，在吸附膜的中间部位加50-80μlRNasefreewater（事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟,或者另外再加30μlRNasefreewater，离心1分钟，合并两次洗脱液。1.2.3．cDNA合成：⑴在冰浴的试管中加入模板总RNA2μg、引物Oligo(dT)18(0.5μg/μl)1μl，然后用无RNA酶去离子水定容至11μl。⑵轻轻混匀后，在70℃水浴5分钟后，冰浴。⑶将试管冰浴，再加入4μl5×ReactionBuffer、0.5μlNaseInhibitor(40U/μl)、2μldNTPMix(10mmol/L)，加水至19μl，轻轻混匀后，在37℃水浴5分钟。⑷轻轻混匀后离心3~5秒。加入1μlM-MLVRT（200U/μl），终体积为20μl。⑸反应混合物42℃水浴60分钟。⑹在70℃加热10分钟结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。1.2.4．定量PCR引物合成见表1，荧光定量PCR反应体系为每个管中加入cDNA4μl，10pm/μl引物各1μl，SYBRPCRmix25μl，去离子水17μl，总体积50μl；反应程序如表2。反应结果可用如下公式计算：表达量比值=2-△△Ct（其中△△Ct=［Ct目的基因（样品）-Ct管家基因（样品）］-［Ct目的基因（对照）-Ct管家基因（对照）］）表1定量PCR引物设计酶正向引物反向引物taxadien-5-α-ol-O-acetyltransferasetaxoid10-βhydroxylasetaxadiene5-α-hydroxylaseDBATtaxadienesynthase(tasy)TBTGGPPS18sTAGTATATGCGATGGACGAGGAGACATGGCAAGTAGTTCAGGTTCTTCTCTGCTCCATGCCTCCACAATCGTGACACCCCGTTCTGGGTCCTGGTCCTGTCGTAATGATGTAGATATGATTGAGCGAGTGGCTGAATTGGCGACGAGAGACAGGTCTGTGATGCCCTTAGAGTGTATAGGATCTTCAGGCTTCAGCATGTGTAGTATAAGGCGTCGATAGCATTCTGGATTGGAAGGTCTACTTCATCAAATCCCAATCGACCTTGCTAGTGCCAGTGCCTGGGAGGCATTGTAGACTGGCCTGAATGCAATGTAATCTGTACTGGGAATTCCTCGTTCATG表2PCR反应程序循环数Step温度时间检测说明1195℃2minoff起始模板变性40195℃15secoff模板变性260-65℃15secoff退火372℃30secon延伸80160-66℃10sec+0.5℃每增加0.5℃反应10s2结果与分析2.1喷施MJ对紫杉醇的含量影响从图3中可以看出喷施MJ后叶片中紫杉醇的含量的变化趋势在前16天和对照的变化趋势一致，且无显著差异，但到了第20天，对照中紫杉醇含量有所降低，而MJ处理的紫杉醇含量有所上升，其含量为对照的2.4倍，差异显著。图3茉莉酸甲酯（MJ）对紫杉醇含量的影响2.2喷施MJ对紫杉醇生物合成代谢相关基因表达的影响图4东北红豆杉RNA定量PCR产物图谱从图4可以看出，叶片中提取得细胞总RNA条带清晰，可以用于定量PCR检测，检测结果（见表4）表明：MJ处理能有效激发各种关键酶基因的表达,但不同基因应答诱导的特点不一样，同一基因在处理后不同时间的表达也有所不同。茉莉酸甲酯处理后第4天，7种关键酶基因均受诱导表达，其中GGPPS、taxadien-5-alpha-ol-O-acetylt