PCR-DGGE技术

PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最早是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，因此它们会在胶中不同的位置分开。然而，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时他们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC片段可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链变性剂浓度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。当加入GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能区分开来。二、实验步骤1.样品预处理2.样品DNA的提取及纯化提取方法根据各样品特点自主选择。3.PCR扩增TouchdownPCRmethod用于DGGE的PCR引物及其扩增程序：（1）V3区的DGGE引物200bp左右的片段正向引物：341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)；5`GC-clamp，有利于检测发生于高熔点区的突变.反向引物：518R(5’－GTATTACCGCGGCTGCTGG－3’)PCR条件：10xPCRbuffer2.5ulMgCl2(25mmol/L)2.5uldNTP(10mM/L)0.5ulforward-pri(10pmol/ul)0.5ulreverse-pri(10pmol/ul)0.5ulTemplateDNA1~2uladdddH2Oto25ulPCR程序：94℃5min（Taqadded）94℃1min65℃1min72℃1min--------------------------------------------20cycles之后每两个循环降低复性温度1℃--------------------------------------------94℃1min55℃1min72℃1min94℃1min55℃1min10cycles72℃1min72℃7min（2）V3～V5区的DGGE引物高于500bp的片段①Bacterial正向引物341－357：341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)；反向引物907－926：907R(5’CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’)PCR程序：94℃5min（Taqadded）94℃1min65℃1min72℃1min--------------------------------------------20cycles之后每两个循环降低复性温度1℃--------------------------------------------94℃1min55℃1min12cycles72℃3min72℃7min②Archara正向引物344－363：ARC344F-GC（5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3’）反向引物915-934：ARC915R（5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’）PCR程序：94℃5min（Taqadded）94℃1min65℃1min72℃1min--------------------------------------------20cycles之后每两个循环降低复性温度1℃--------------------------------------------94℃1min61℃1min12cycles72℃1min72℃10min（3）V6～V8区的DGGE引物480bp左右的片段正向引物：968F（5’-CGCCGGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTA－3）反向引物：1401R（5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’）PCR程序：94℃5min（Taqadded）94℃1min65℃1min72℃3min--------------------------------------------20cycles之后每两个循环降低复性温度1℃--------------------------------------------94℃1min55℃1min15cycles72℃1min72℃10min4.预实验（DGGE条件优化）DGGE有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯度或温度梯度的方向和电泳方向垂直；后者是指两个方向是平行的。在分析微生物群落的PCR扩增产物时，一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围。垂直电泳时，胶从左到右是变性剂梯度。在胶的左边，变性剂浓度或温度低，DNA片段是双链形式，因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的另一边，由于变性剂浓度或温度高，DNA一进入胶立刻就发生部分解链，因此迁移很慢。在胶的中间，DNA片段有不同程度的解链。在变性剂浓度或温度临界于DNA片段最低的解链区域时，DNA的迁移速率有急剧的变化。因此，DNA片段在垂直胶中染色后呈S形的曲线，根据垂直电泳确定的范围，再用水平电泳来对比分析不同的样品。5.制胶（1）试剂配制①40%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(Acrylamide/Bis37.5:1)RagentamountArylamide38.96gBis-acrylamide1.04gAddddH2Oto100ml②10%过硫酸氨(Ammoniumpersulfate)ReagentamountAmmoniumpersulfate0.1gAddddH2O1.0mlstoreat-20℃foraboutaweek③50×TAEBufferReagentAmountTrisBase242g121gAceticacidglacial(冰乙酸)57.1ml28.55ml0.5MEDTApH8.0100ml50mlAddddH2Oto1Lto500mlStoreatroomtemperature④Denaturantstocksolution(8.0%)For100mluse:0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%40%Acrylamide/Bis(ml)202020202020202020202050×TAEBuffer(ml)22222222222Formamide(ml)0481216202428323640Urea(g)04.28.412.616.82125.229.433.637.8420%25%35%45%55%65%75%40%Acrylamide/Bis(ml)2020202020202050×TAEBuffer(ml)2222222Formamide(ml)0101418222630Urea(g)010.514.718.923.127.331.5（2）制胶①高浓度端：Syringe，高浓度胶70%Denaturant/8.0%gel10ml14.5ml20ml24ml10%APS80µl116µl160µl192µlTEMED6µl8.7µl12µl14.4µl②低浓度端：Syringe，低浓度胶30%Denaturant/8.0%gel10ml10%APS80µlTEMED6µl③上相非变性胶5ml0%Denaturant/8.0%gel40µl10%APS3µlTEMED（3）制胶步骤按照Bio-Rad475型梯度生成仪使用说明书操作。具体操作步骤见视频教程及网上资源（Harvard）。灌完胶后，立即用水冲洗注射器，避免凝固，并用水饱和正丁醇封胶，使液面水平保持水平。约凝固1h后，再用非变形胶灌注。插入梳子，待凝固，出现缩胶补充。（4）DGGE电泳条件（根据不同PCR产物电泳条件不同）水温：60℃胶浓度：8.0%（丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺37.5:1）变性梯度范围：30%-70%（100%变性剂中含7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺）上样量：15-20ulPCR产物电压：200V电泳时间：6h30minDGGE运行条件：1xTAEbuffer，60℃，80V运5min，200V运行6.5h（5）染色①EB染色：染色20min，然后用去离子水漂洗几次，254nm紫外分析。②Bassam硝酸银染色步骤：①固定：10%的冰乙酸，30min（固定和终止共配置900ml）固定液：10%乙酸900ml90ml100%+810mlddH2O=900ml10%乙酸银染试剂：1g/LAgNO3，1.5ml/L37%甲醛500ml（提前配制）0.5gAgNO3+0.75ml37%甲醛+ddH2O定容至500ml显色试剂：Na2CO330g/L，1.5ml/L37%甲醛800ml（使用前加入200µl10g/LNa2S2O3）24gNa2CO3+1.2ml37%甲醛+ddH2O定容至800ml0.01gNa2S2O3+1mlddH2O，用时取200µl6.样品的DGGE分析(1)切胶PCR-DGGE验证用细菌的正向引物341－357：341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)、反向引物907-926：CCGTCAATTCMTTTGAGTTT；古菌的正向引物344-363：ARC344F-GC②洗脱：双蒸水洗脱，3×2min③银染：AgNO31g/L，37%的甲醛1.5ml/L，30min。配制500ml④洗脱：双蒸水，1min（沥干时间不要超过10s）⑤显色：30g/LNa2CO3，37%的甲醛1.5ml/L，200µl10g/LNa2S2O3。10℃下预冷。配制800ml.⑥终止：10%的冰乙酸；5min⑦洗胶：用无菌双蒸水洗胶，3×3min（5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3’）、反向引物915-934：ARC