pcr中GC含量过高的问题

PCR中GC含量过高的问题DNAmolecule:4849Length=1212basepairsMolecularWeight=370809.00Daltons,singlestrandedMolecularWeight=741128.00Daltons,doublestrandedG+Ccontent=70.96%A+Tcontent=29.04%NucleotideNumberMol%A17314.27C43836.14G42234.82T17914.77解决：1.由于基因中GC含量过高，就不应该用普通的buffer了，而应该用特殊的---GCbuffer，对于TM值可以做一下梯度PCR，GCbuffer可以在一些公司都能买到。买TAKALA的GCbufferforPCR.还有，设计一段合适的引物确定你模板中确实有你的目的片段也是很有必要的。2.只是为了PCR获得基因的话，你可以尝试用68度/94度这种两步PCR法，3.gc含量是有些高，建议你换一种保真性比较高的酶（建议还是不要用japan公司的），现在有好多高保真的酶（sigma的jumpstarttaqetal）都可以扩增高gc的模板；另外，DMSO也是一种办法，但是，这种办法需要你凭经验确定加入的量，一般来说5%已经足够了，最好不要超过10%，因为过高的DMSO反而会一直taq酶对pcr的特异性扩增。4.用Takara的long-TaqwithGCbuffer效果很好。我做的是链霉菌，所以GC含量也在70多。我P的效果很好5.可以试着加点DMSO、NaOH、甘油等东西试试。以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCRBuffer卖.6.如果实在不行，就用advantage2highGCtaqpolymeras.（clontech),效果好，就是贵了点。可以用双温法试试，比如35个循环，总变性之后，前五个循环双温即没有延伸，后三十个循环三温，具体温度根据引物Tm值定。我试过效果不错。如果基因的5’端含有丰富的GC碱基，设计的PCR引物Tm值很高，用普通PCR很难理想地扩增出此基因。用热启动（hotstart）和降落-PCR，能取得了较好效果。在PCR开始时加入Qiagen公司的HotstarTaqDNA聚合酶，并延长起始变性时间如95℃变性15min，能使模板DNA完全变性，以便提供最大数量的引物配对位点，可避免引物二聚体和非特异性配对。PCR反应过程中，首先在高于引物Tm值的72℃左右扩增几个循环，然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近，在随后的循环中，对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何级扩增，在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此，降落-PCR既能增加反应特异性，又能提高PCR产物的产量。为你设置循环条件为：①95℃变性15min；②94℃45s，72℃30s，退火温度每循环降低2.0℃，72℃45s，5个循环；③94℃45s，设置退火温度梯度从55℃到65℃30s，72℃45s，30个循环；④72℃延伸10min。几点建议：先优化反应条件，GC丰富的序列，退火温度其实也不用刻意加高主要是变性温度，预变性96度5分钟然后再加酶（热启动）一般循环的变性温度用95度比94好，还不行还可以再加高还有DMSO和甘油，各加到5％就足够了，光加DMSO有的时候会使酶的半衰期下降引物GC含量分别高达70%以上时，用普通PCR很难理想地扩增出此基因。因为G、C之间形成三对氢键，解链所需能量较高，故模板较难打开，在常规变性温度下，DNA模板变性不完全，同时由于单链的G＋C丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹环二级结构，而使PCR引物难于结合到模板上，DNA聚合酶也难于延伸或停止延伸，结果常出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶基因。在扩增高含量GC的基因时，可对PCR条件进行几个方面的优化：1、热启动（hotstart）PCR：使用热启动PCR，一方面通过扩增前的加热，使双链模板充分解链，另一方面，通过高温启动反应，促进引物的特异性复性与延伸；增加有效引物的长度，提高了反应的特异性与灵敏性，并减少了引物二聚体或多聚体的形成，从而能提高GC富集区的扩增效率。我们采用Qiagen公司提供的HotstarTaqDNA聚合酶，此酶含有一种热不稳定性保护抗体（Taqstartantibody），该抗体在低温时与Taq酶结合，抑制其活性，当反应体系达到一定的温度后，这种热不稳定性保护抗体就从Taq酶上脱落下来，Taq酶得以恢复活性。我们在PCR开始时就加入HotstarTaqDNA聚合酶，并延长起始变性时间如95℃变性15min，能使模板DNA完全变性，以便提供最大数量的引物配对位点，避免了引物二聚体和非特异性配对。2、降落（TD）-PCR：PCR开始时的退火温度高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值并最终低于这个水平。退火温度选择应根据引物的长度及G+C的含量，在Tm值允许的范围内，较高的退火温度可大大减少引物和模板的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。首先在高于引物Tm值的温度扩增几个循环，然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近，在随后的循环中，对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何级扩增，在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此，TD-PCR既能增加反应特异性，又能提高PCR产物的产量。3、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、模板等也影响PCR的产量及产物特异性。它们的浓度过高反应特异性降低，过低则PCR产物产量减少，即高特异的反应条件可能与高产量的反应条件并不一致。2、TransStartFastPfuFlydnaPolymerase特点：(1)新型热启动；(2)快速扩增；（3）高保真性；（4）强扩增能力；（5）高灵敏度；（6）高产量；适用范围：1.扩增高GC含量、具有二级结构等复杂模板。2.高保真扩增，基因克隆，基因定点突变等。3.长片段扩增。3、当然，也可以尝试对模板进行预变性，如加入适当的NaOH处理模板；8.如果GCbuffer+LA扩不出还可以考虑用TaKaRa的PrimerStAR虽然有广告嫌疑，虽然不喜欢R货。但是确实好使，我有几个片段在3k作用，GC含量70%+，用gcbufferI和II都试过不好使，后来用primerstar68°两步法扩出来了9．NEB现在有两种DNA聚合酶适合扩增高GC含量的片段：1.OneTaqDNA聚合酶，非常适用于扩增高GC含量或者复杂模板的DNA，其中含有GCBuffer，并且还有GCEhancer，方便您的使用，并且有DMSO可以供选择使用，该聚合酶的扩增长度为6kb，保真度为Taq酶的两倍；2.Phusion超保真DNA聚合酶，也提供GCBuffer，该聚合酶的保真度是Taq的50倍，可以扩增长度为20kb的片段，扩增效率高；您可以了解相关信息，请您参考。