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实验六PCR基因扩增（6学时，4小时30分钟）一、实验目的：通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。二、实验原理：聚合酶链反应的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧相互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火、延伸若干循环后，DNA扩增2n倍。反应体系：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物，耐热Taq聚合酶。包括高温变性（94oC）、低温退火（50o-60oC）、中温延伸（72oC）三个阶段。三、仪器、材料、试剂：1.PCR热循环仪2.琼脂糖凝胶电泳系统3.紫外透射仪4.PCR管、移液枪5.DNA模板6.dNTP混合物7.引物对(正向引物和反向引物)8.Taq酶9.琼脂糖10.0.5×TBE11.10×PCRbuffer12.loadingbuffer四、实验步骤：1.根据模板，设计引物。2.在PCR管内配置25µl反应体系：2.5mmol/LdNTP混合物2μl10×PCRbuffer2.5μl正向引物1μl反向引物1μl模板DNA0.5μlTaq聚合酶0.5μl双蒸水17.5μl3.根据条件，设计PCR程序，进行扩增。（编辑程序：79、80、81、82、83，使用PCR仪上的编辑键option—edit—enter—store--home）(1)94oC预变性5min(2)94oC变性30s(3)55oC退火30s(4)72oC延伸1min(5)重复步骤(2)、(3)、(4)30次(6)72oC总延伸5min4.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果制备1%琼脂糖凝胶，25μlPCR产物+10μlloadingbuffer，点5-7个孔。第一个孔点3µlMaker，后5-6个孔各点6μl产物，50V电泳90min。（可以根据情况点样）。5.电泳完毕，关上电源，取出凝胶，在染色室紫外透射仪下观察结果。（注意要带上手套，不要把有机玻璃内槽拿到染色室）五、实验结果：基因存在处显示出橘红色荧光条带。六、分析讨论：1.DNA自然复制与PCR扩增有什么不同？答：DNA自然复制是在体内进行的，不需要经热循环，复制和解旋是同时进行的，属于半保留复制，有解旋酶等多种酶共同参与，引物是RNA，复制结束后要被切掉。而PCR扩增则是在体外进行的，用的是热变性的方法使DNA双链解开，先解旋后复制，使用的是耐热的Taq酶，引物是DNA。2.为什么合成酶用的是特殊的Taq酶？有什么意义？答：因为该实验使用的是热循环法，最高温度达94oC。一般的聚合酶在该温度下已失活，Taq是耐热的DNA聚合酶，发现于水生栖热菌内，生存于温泉、蒸汽管道处的细菌，Taq酶耐90oC以上的高温而不失活。在发现Taq酶之前，每次做PCR，每个循环需要加一次聚合酶，非常麻烦。发现Taq酶后，使PCR反应变的简单，得以推广，成为生物医学领域一项革命性创举和里程碑。3.在自然温度下，加入解旋酶，能否完全模拟体内环境实现PCR反应？答：不能，虽然有解旋酶，但体内DNA复制为细胞的周期调节，非常精细。目前的环境不能实现自然温度的PCR反应。4.PCR技术在现实生活中的应用？答：①可以通过PCR扩增基因，得到大量的基因，为基因工程提供方便。②用于病理检测和基因治疗方面。③用于法医检测和比对。④用于人类学研究。5.PCR实验注意事项有哪些？答：①为避免污染，不能直接用手拿PCR管，要用镊子取。加试剂的时候，不能说话。②引物浓度不能太高，否则，会发生错配现象，反应的特异性下降。③必须要有引物。因为聚合酶在拷贝下一个碱基之前，一定会检验上一个碱基有没有复制准确。6、本实验需要掌握的知识和技术？答：①PCR反应各种酶制剂的使用方法。②体内和体外扩增的差别。导语：从高中以来，我们一直在学PCR反应，也是考试的重要内容。但是我们始终没有做过这个实验。今天我们就做PCR实验。首先看看大家对这个知识的了解程度。体内DNA复制的过程是什么？PCR反应时80年代中期（1985年）发展起来的体外核酸扩增技术，能把一个基因扩增成百万个，供科研分析用。1993年美国MULLIS获得诺贝尔化学奖。知识点：1、PCR仪类似于3个不同温度的水浴锅。2、dNTP为三磷酸脱氧核糖核苷，是dATP（三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸）、dGTP（三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸）、dTTP（三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸）、dCTP（三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸）。在PCR反应延伸中，需要这几种核苷酸，在聚合酶的作用下，以碱基互补配对的原则，与模板链进行连接，从而达到复制的目的。