PCR实验步骤

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qRT-PCR实验步骤应用LightCycler®/LightCycler®480SystemRealTimePCR扩增仪的操作方法一、按下列组分配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)(2×)10.0μl1xPCRForwardPrimer(10μM)0.8μl0.4μMPCRReversePrimer(10μM)0.8μl0.4μMcDNA模板(100ng)5.0μlDEPC水3.4μlTotal20.0μl注意:1、通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在0.1~1.0μM范围内调整引物浓度。2、在20μl的反应体系中,DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定最佳的DNA模板添加量。另外,2StepRT-PCR反应的cDNA(RT反应液)作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。二、进行RealTimePCR反应LightCycler®480System:Stage1:预变性95℃30s(升温速率4.4℃/s)1CycleStage2:PCR反应分析模式:定量分析95℃5s(升温速率4.4℃/s)60℃30s(升温速率2.2℃/秒,AcquisitionMode:Single)40CyclesStage3:溶解分析模式:溶解曲线95℃5秒钟(升温速率4.4℃/秒)60℃1分钟(升温速率2.2℃/秒)95℃(升温速率0.11℃/秒,AcquisitionMode:Continuous,Acquisitions:5per℃)1cycleStage4:降温40℃30秒钟(升温速率2.2℃/秒)1cycle三、实验结果分析反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线,进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。

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