PCR技术在中药鉴定中的应用

PCR技术在中药鉴定中的应用[摘要]以聚合酶链式反应（PCR）技术为支撑的现代分子生物学技术，包括随机扩增多态性DNA（RAPD）技术、ISSR-PCR技术、PCR-RFLP技术、mRNA差异显示技术、基因测序技术及基因芯片技术在中药鉴定中的应用，现代分子生物学技术的蓬勃兴起将极大地推动中药鉴定的发展。[关键词]PCR技术；分子生物学技术；中药鉴定千百年来，中药在维系国人的身体健康方面发挥了不可替代的作用。中药包括植物药、动物药和矿物药，品种繁多，加之各地的用药品种和用药习惯不尽相同，同名异物和同物异名现象屡见不鲜。为规范药材市场、鉴定中药真伪优劣，确保中药的质量与疗效，建立一套准确、简捷、迅速的鉴定方法迫在眉睫。近年来分子生物学的发展突飞猛进，特别是聚合酶链式反应（PCR）技术的问世，推动分子生物学的各个领域向纵深发展[1]。基于PCR技术的现代分子生物学操作在中药鉴定中得到应用，以其独具的准确性和可靠性，弥补了传统中药鉴定中的许多不足，展现出其他方法难以比拟的优势。本文以PCR技术为切入点，着重介绍目前在中药鉴定中运用较多的几种分子生物学操作技术，希望能够抛砖引玉，合众人之力增加中药鉴定中的现代元素，推动中药鉴定方法的改进与革新。1PCR技术概述PCR技术由美国Karray等学者于1985年首创，并由美国Cetus公司开发研制。PCR技术原理是根据已知DNA片段序列，人工合成与该DNA两条链末端互补的寡核苷酸引物，在酶促作用下将待检DNA序列进行体外扩增。PCR反应体系基本成分包括模板DNA（待扩增DNA）、引物、4种脱氧核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。多聚酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。经变性、退火和延伸若干循环后，DNA扩增2n倍。变性是加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链的过程；退火是使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补；延伸是在DNA聚合酶的作用下，以单链DNA为模板，利用四种脱氧核苷酸，按5’→3’方向复制出与模板互补的DNA链，上述三步为一个循环。每经过一个循环，样品中的DNA量应增加一倍，新形成的链又可作为新一轮循环的模板。分子生物学技术的核心是聚合酶链反应(PCR)，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，能在最短的时间内扩增。由此衍生出新PCR技术，在医学上的临床诊断和治疗中意义重大。PCR技术使人们能够在体外进行DNA的复制，它的意义在于DNA是遗传密码的载体，具有相对的遗传稳定性，每种生物都有其固定的遗传密码。只要得到某种物质的微量细胞并将其细胞内的遗传物质提取出来，再通过PCR技术将其扩增，就会准确无误地判断该物质，进而判断该物种。PCR技术以其独具的可靠性和准确性，在中药材基原鉴定和真伪鉴别方面拥有广阔的应用空间。2基于PCR技术的现代分子生物学技术PCR技术是现代分子生物学的基石，该项技术的问世具有划时代的意义。以PCR技术为基础，分子生物学领域衍生出多种新的实验操作技术，在生命科学的各个领域均得到广泛的应用。本文仅对应用于中药鉴定过程的几种操作技术进行介绍。2.1RAPD技术RAPD即随机扩增多态性DNA，该技术建立在PCR技术基础之上，可对整个未知序列的基因进行多态性分析操作。RAPD技术以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物，在热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）作用下，进行PCR扩增。扩增产物经电泳、染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。目前，RAPD技术已应用于中药材的种质鉴定及伪品鉴别等方面。徐鹏等[2]运用RAPD技术对广西钩藤属药用植物进行遗传多态性分析，获得多态性条带231条，多态率达到88.9%。结果表明，3种广西钩藤属药用植物的聚类结果与其地理分布一致，所得RAPD标记可用于钩藤属药用植物的多态性研究；李雄英等[3]运用RAPD技术对绞股蓝及其伪品进行DNA指纹图谱的鉴别研究，实验结果证实该技术可有效地鉴别绞股蓝及其伪品乌蔹莓。2.2ISSR-PCR技术简单序列重复区间（inter-simplesequencerepeats，IS-SR）是近年来发展起来的一类新型的分子标记技术，具有多态性高和重复性好等优点，已广泛用于药用植物的鉴定和遗传多样性研究[4]。柴素芬等[5]以象头山芸香科植物为研究对象，从DNA提取、退火温度、循环次数、引物筛选等方面研究ISSR反应及优化条件，建立和优化芸香科药用植物的ISSR反应体系。结果表明，ISSR技术适合于芸香科药用植物的品种鉴定，同时可为芸香科药用植物的资源评价提供依据。2.3PCR扩增的特定片段的限制性位点分析限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）利用放射性标记的探针，通过杂交显示特定的基因组DNA酶切片段，从而构建多态性的DNA图谱。它代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。PCR-RFLP技术综合RFLP技术与PCR技术二者的优势，用特异性的引物先对模板DNA进行扩增，获得特异性的扩增产物，之后利用多种不同的限制性内切酶对扩增产物进行酶解，构建物理图谱，分析限制性位点在分类群中的差异。该方法准确可靠，重复性好，在中药鉴定研究中有一定的应用报道。吴平等[6]从5种海马干标本中提取DNA，利用PCR技术扩增12SrRNA和细胞色素b基因片段，对扩增产物进行RFLP分析。实验结果证实，采用PCR-RFLP技术可鉴别出其中的两种海马。2.4mRNA差异显示技术mRNA差异显示技术通过将总RNA反转录成单链cDNA，然后进行PCR扩增,由此分离出不同分子大小的DNA，选择有差异表达的基因进行序列分析。该技术具有快速、多功能、所需RNA量少和重复性高等优点而被广泛用于分离克隆真核生物差异表达的基因[7]。目前，该技术在药学领域中的应用仅处于起步状态,借助该技术可以将栽培品种与野生种、道地药材与普通药材之间的差异鉴别出来。因此，mRNA差异显示技术在中药材的质量鉴定方面将拥有广阔的应用空间。2.5基因测序基因测序是对药材特定的基因片段进行精确的DNA序列分析，并加以比较，从而达到鉴别药材的目的。常用的基因片段包括线粒体细胞色素基因和rRNA基因等。用于基因测序的基因在种内高度保守，而在种间序列的差异较大，适用于中药材种间的鉴定。徐丽等[8]从冬虫夏草与其他品系虫草及其混淆品虫草中提取DNA，对核糖体基因（rDNA）进行测序，设计18S基因特异性引物进行扩增，扩增产物经纯化后，直接测序。结果表明，冬虫夏草与西藏白草、西藏黑草、无头草、默勒草的18S序列相似度为100%；与亚香棒、北虫草的18S序列相似度分别为91.37%和91.74%。由此可见，18S序列可有效地鉴别冬虫夏草及其混淆品北虫草和亚香棒虫草。此外，基因测序技术也被报道应用于三七及其伪品的遗传背景差异分析、巴戟天[9]道地性研究及半夏[10]的基原鉴别。2.6基因芯片基因芯片又称DNA芯片，是专门用于核酸检测的生物芯片。基因芯片的主要技术流程为：芯片的制备→样品的制备→杂交反应→芯片信号的检测与分析→芯片数据的统计分析和生物学分析。即在固相载体上按照特定的排列方式固定大量序列已知的DNA片段，将样品基因组DNA或RNA经过PCR或RT-PCR扩增等技术掺入标记分子后，与已知序列杂交，通过荧光检测系统对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，利用计算机软件进行数据分析后，即可获得样品中大量的基因序列特征或基因表达特征信息。基因芯片技术可为植物种属的验证与质量控制提供一种快速、高质量的检测工具。杨忠等利用基因芯片技术对多种贝母根茎的基因组DNA进行操作，结果显示不同贝母种属可在芯片不同位置检测到荧光信号，从而提供了一种快速高效的集基因分型与中药鉴别于一体的方法。3展望与传统的中药鉴别方法相比，基于PCR技术的分子生物学鉴定技术具有准确性高、重现性好、稳定、可靠的优点。利用现代化分析技术可准确鉴别中药的真伪，从而完善中药质量评价体系，保证中药安全、有效、可控。目前，最重要的是要充分了解各项技术的优势，以便取长补短、综合利用，满足市场对药材准确鉴定的需求。[参考文献][1]金宇良.PCR技术的研究进展[J].现代农业科技，2012，10：47-48.[2]徐鹏，吴耀生,黄瑞松，等.3种广西钩藤属药用植物的RAPD多态性分析[J].时珍国医国药，2012，23（3）：702-705.[3]李雄英,罗育,吴耀生,等.RAPD技术在药用植物绞股蓝鉴别中的初步研究[J].武汉植物学研究，2008，26（3）：251-254.[4]关萍，马丹炜，王贵侠，等.利用ISSR标记对天麻的贵州种群遗传多样性分析[J].北京林业大学学报，2007，29（6）：35-40.[5]柴素芬，陈兆贵，洪彩霞，等.芸香科药用植物ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J].安徽农业科学，2008，36（33）：14433-14435，14512.[6]吴平，周开亚，张朝晖，等.海马类药材的分子遗传标记鉴定研究[J].药学学报，1998，33（3）：226.[7]王新超，梅菊芬，杨亚军.mRNA差异显示技术在植物学领域的应用[J].浙江农业学报，2008，20（2）：144-148.[8]徐丽，王小平，张雪峰.冬虫夏草与其他品系虫草及其混伪品的18Sr-RNA基因测序鉴别研究[J].中国医药指南，2012，10（12）：413-415.[9]丁平，刘瑾，邱金英，等.基于核糖体rDNAITS序列变异探讨巴戟天道地性[J].药学学报，2012，47（4）：535-540.[10]刘玉萍，曹晖，王孝涛.基因测序技术在中药质量研究中的应用（Ⅰ）山东郓城猴头半夏基原的DNA测序鉴别[J].药物分析杂志，2001，21（6）：423-424.