医学分子生物学技术 蛋白质

2019/8/1512019/8/152第一章蛋白质的分离与纯化第一节蛋白质分离纯化的一般原则一、蛋白质分离纯化技术及其依据表1－1主要的蛋白质分离纯化方法及依据性质分离方法分子大小与形状超滤、透析、密度梯度离心、凝胶过滤层析、凝胶电泳溶解度沉淀法、相分配法、分配层析、结晶、溶剂抽提、逆流分配电荷分布电泳技术、等电点沉淀、离子交换层析、聚焦层析、等电聚倍数电泳生物功能专一性亲和层析疏水性疏水作用层析、反相高效液相层析2019/8/153第一章蛋白质的分离与纯化二、蛋白质纯化的一般设计原则1、目的蛋白的分离和纯化应该尽可能选择来源方便、成本低、易操作的组织或细胞作为原料；2、要建立一个特异、快速、可重复、经济的目的蛋白活性检测方法；3、蛋白质分离纯化工艺的设计应该分级分离、先粗后细的原则；4、纯化条件要尽可能温和。2019/8/154第一章蛋白质的分离与纯化第二节蛋白质的层析(chromatography)分离一、层析技术的发展简史及科学意义二、层析技术的基本原理固定相：在层析系统分离过程中静止不动的相。流动相：在层析系统分离过程中在载体上延一定方向移动的相。2019/8/1552019/8/1562019/8/157塔板理论：K＝＝(溶质在固定相中的浓度)Cs(溶质在流动相中的浓度)Cm把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。2019/8/158塔板理论假设：1.在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。3.所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4.分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。2019/8/159简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n=L/Hn称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。2019/8/15102019/8/15112019/8/15122019/8/1513洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图。层析的展开方式2019/8/1514顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图。2019/8/15152019/8/1516迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先一纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图。A+BA2019/8/1517层析流出曲线及相关术语色谱流出曲线和色谱峰由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。2019/8/1518基线在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。2019/8/1519色谱流出曲线•色谱流出曲线和色谱峰•基线（a）•峰高（h）信号进样空气峰色谱峰ha2019/8/1520保留值死时间t0不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。信号进样t0因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与t0的比值计算，即ū=L/t02019/8/1521信号进样tr2.保留时间tr试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。2019/8/15223.调整保留时间tr´•某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tr´=trt0•由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。•保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。2019/8/15234.死体积V0指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。V0=t0Fco式中Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。•仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。2019/8/15245.保留体积Vr指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：Vr=trFco6.调整保留体积Vr某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。Vr=VrV0=trFco2019/8/15257.相对保留值r2,1某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。r2,1=tr2/tr1´=Vr2/Vr1由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。2019/8/1526在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号表示，即=tr(i)/tr(s)式中tr(i)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。2019/8/15271.标准偏差即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2.半峰宽W1/2即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为W1/2=2.3543.峰底宽度W即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是W=42019/8/15282019/8/1529从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。2019/8/1530三、离子交换层析离子交换层析(ionexchangechromatography)利用物质的电荷与层析载体(离子交换剂)电荷之间的相互作用达到分离纯化的目的的层析方法称离子交换层析。离子交换剂：离子交换层析所用的固相基质，由不溶于水的、具有网状结构的高分子聚合物组成。2019/8/15312019/8/1532离子交换层析的操作1、样品的准备：固体样品必须溶于适当离子强度和pH的缓冲液中。组织液或细胞裂解液用缓冲液稀释后可直接上柱。盐析样品必须除盐后才能进行分离。2、离子交换剂的处理：根据被分离样品的性质选择合适的离子交换剂，离子交换剂在使用前须先进行处理。2019/8/15333、层析柱的准备：离子交换层析柱一般选择粗短柱为宜，使得样品在分离的同时进行浓缩。离子交换剂的用量根据样品量和交换剂的交换容量确定。4、样品分离：上样量的多少与目的蛋白的性质、浓度及交换剂的亲和力有关。在分离过程中，应注意2019/8/15341）样品的浓度不宜过大2）溶解蛋白质样品的缓冲液的离子强度要低于起始缓冲液3）上样速度不要过快4）上样缓冲液的pH应合适5、洗脱2019/8/15356、洗脱液的鉴定和回收7、离子交换剂的再生与储存2019/8/15362019/8/1537兔γ－球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纤维素柱上的层析分离2019/8/1538天花粉各成分用特种离子交换剂层析分离2019/8/15392019/8/15402019/8/1541二、分子筛原理2019/8/15422019/8/15432019/8/1544凝胶过滤的分配系数K=(Ve-V0)(Vi)2019/8/1545主要凝胶过滤介质的牌号及骨架结构2019/8/1546葡聚糖凝胶(G)型号分离范围(分子量)吸水量(克／克干凝胶)膨胀体积(毫升／克干凝胶)浸泡时间蛋白质多糖20～25℃90~100℃107007001.02-33115150015001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-407252019/8/1547亲和层析：利用生物分子间特殊的亲和关系进行的分离方法。是蛋白质分离纯化的最有效的方法之一，有时甚至可以仅用一步纯化即可达到纯化目的。只要被分离蛋白、配基和载体之间能形成以下的关系，即可进行亲和层析2019/8/15482019/8/1549基本原理：亲和层析法利用了生命现象中生物分子之间非常特异的相互作用而进行分离纯化的方法。生物体内能发生特异的相互作用的成分有：酶与酶的底物酶与酶的抑制剂酶与酶的变构效应剂酶与酶的辅酶激素与细胞膜上的受体维生素与结合蛋白核酸抗原与抗体外源凝集素与红细胞表面的抗原2019/8/1550特异性强分辨率高回收率高层析柱的再生方便亲和层析特点特别适用于微量生物活性物质的分离2019/8/1551•电泳是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象•正极负极带负电粒子带正电粒子蛋白质的电泳分离2019/8/1552++++++++--------++++++++--------蛋白质胶体颗粒的沉淀带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸碱碱脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒（沉淀）带正电荷的蛋白质（疏水胶体）带负电荷的蛋白质（疏水胶体）碱酸（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）2019/8/1553带电颗粒在电场中所受到的电场力F=EQ根据Stoke定律，球形分子在液体中泳动所受到的阻力F’=6πrηv电泳原理：2019/8/1554F=F’即：EQ=6πrηv时，V=EQ6πrη当物质在电场中移动时，受到电场力和液体阻力两方面的力的影响，当电场力和阻力平衡时，带电颗粒作匀速运动，2019/8/1555两个带电颗粒能否分开，由两个颗粒在电泳过程中的迁移率所决定，即U=dlVt或d=UVtldU==VEtVl=dlVt或d1-d2=(U1-U2)VtlΔd=2019/8/1556•迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算：•Ｕ=υ/E=(d/t)/(V/l)=dl/Vt•Ｕ为迁移率（cm2·V-1·min-1）；υ为颗粒泳动速度（cm·s-1）；E为电场强度（V·cm-1）；d为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（